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細胞因子生物學活性檢測實驗
閱讀：567 發(fā)布時間：2019-5-13實驗方法原理 白細胞介素1是一種重要的細胞因子，主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，IL-1不僅對多種免疫活性細胞有重要的調節(jié)功能，而且與發(fā)熱、炎癥發(fā)生以及某些疾病的病理變化有關。目前對IL-1產(chǎn)生水平的檢測主要應用生物學活性檢測的方法。
一、ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學活性
小鼠胸腺細胞在絲裂原刺激下表達IL-1受體，在有IL-1同時存在的條件下，IL-1可協(xié)同絲裂原促T細胞的增殖作用。根據(jù)加入IL-1后增殖水平（3H-TdR摻入率）的增加可計算出樣品中IL-1的活性單位，或計算出刺激指數(shù)。
二、應用EL-4 CTLL檢測IL-1生物學活性
小鼠胸腺瘤細胞系EL4的某些亞克隆細胞表面具有高密度IL-1受體，在IL-1誘導下產(chǎn)生高水平的IL-2，通過用IL-2依賴株CTLL-2檢測IL-2的生物學活性，從而反映檢測樣品中IL-1的水平。
實驗材料 ConAEL4細胞CTLL-2細胞
試劑、試劑盒 FCS RPMI16403H-TdRPPOPOPOP二甲苯
儀器、耗材 濾紙收集儀計數(shù)儀96孔板吸管滴管試管加樣器CO2培養(yǎng)箱
實驗步驟
一、ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學活性
1. 取6～8 周齡C57BL16小鼠，拉頸處死，無菌取胸腺置不銹鋼網(wǎng)篩上，用注射器針蕊研磨成細胞懸液調整細胞數(shù)為1.5×107 /ml
2. 細胞懸液內加入ConA，使終濃度為3 μg/ml，在96孔培養(yǎng)板中加100 μl（1.5×106細胞）
3. 加入不同稀釋度待測樣品和IL-1標準品100 μl/孔（ConA終濃度為1.5 μg/ml），37 ℃ CO2孵箱 66 h
4. 每孔加3H-TdR 0.5 μci，37 ℃ CO2孵箱 6 h
5. 多頭細胞收集儀收獲于9999型玻璃纖維紙上
6. 烤干，移入液閃瓶中，加適量閃爍液，于液閃儀上測β計數(shù)
7. 計算
（1）從IL-1標準曲線上測得IL-1的活性單位
（2）也可用刺激指數(shù)（SI）表示
實驗組cpm
SI＝────── ×100％
對照組cpm
二、應用EL-4 CTLL檢測IL-1生物學活性
1. 用EL4細胞兩步法檢測IL-1活性
（1）收集處于對數(shù)生長期的EL4細胞
（2）洗滌后，用1 ％FCS RPMI1640重懸細胞，并調整細胞濃度2×106 /ml
（3）加處96孔板中，100 μl/孔
（4）加入不同稀釋度的IL-1α或IL-1β，100 μl/孔，同時設1 ％FCS RPMI 1640對照
（5）5 ％CO2 37 ℃培養(yǎng)18～24 小時
（6）按終稀釋度為1∶10～20轉入另一塊96孔板中
（7）用CTLL-2 檢測IL-2活性、檢測方法見"IL-2檢測"
2. 用EL4細胞一步法檢測IL-1活性
（1）用5 ％FCS RPMI 1640調整EL4細胞濃度至2×105 /ml，CTTL-2濃度至4×105 /ml
（2）加入96孔板中，兩種細胞各加50 μl/孔
（3）加入不同稀釋度的IL-1或待測樣品，同時設EL4和CTLL-2細胞對照
（4）置5 ％CO2，37 ℃培養(yǎng)24～28 小時后加入3H-TdR，0.5 μci/50 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 小時
（5）收集樣品，β計數(shù)
收起
注意事項
一、ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學活性
1. 不同品系小鼠對IL-1的反應性有差異，據(jù)國內資料報道以C57BL為好。
2. 不同周齡小鼠胸腺細胞對ConA反應性不一，一般選用6～8 周齡，小于5 周或大于10 周齡小鼠胸腺細胞對ConA反應不穩(wěn)定。
3. ConA促絲裂原作用要進行預試，一般采用亞適劑量。
二、應用EL-4 CTLL檢測IL-1生物學活性
1. 在一步法檢測IL-1時，其EL4細胞濃度不宜超過1×104 /孔，血清終濃度應＜5％。
2. 在二步法檢測IL-1時，其EL4細胞濃度在2×105 /孔時，轉移上清稀釋度不宜低于1∶8，其誘導時間應12～24 小時間為佳。誘導血清濃度應≤1％。
3. 在檢測經(jīng)誘導的上清中IL-1時，應避免使用A23187，TPA和ConA等較強的能誘導EL4細胞產(chǎn)生IL-2的誘導劑來刺激IL-1的產(chǎn)生。