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對于一個新的靶分子建立實時 PCR 定量分析的過程包括：①設計步驟一 PCR 引物和探針的選擇；②根據特定分析的要求，選擇實時 PCR 的檢測方法。使用 SYBRGreen 的實時 PCR 通常被用于優化引物，且被主要用于在研究中檢測 PCR 產物 TaqMari 探針和分子信號提供了更好的特異性。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉試劑、試劑盒    MgCl2探針HotStmMix正向和反向擴增引物模板 DNA
儀器、耗材    PCR 儀反應管、毛細管或 96 孔的微量滴定板
實驗步驟    
一、材料

1. 緩沖液和溶液

MgCl2(25 mmol/L)

探針（例如分子信號）或 SYBRGreen(MolecularProbes)

2. 酶和酶緩沖液

HotStmMix，2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 緩沖液和 dNTP)

3. 核酸和寡核苷酸

正向和反向擴增引物

模板 DNA

4. 設備

實時 PCR 儀

合適的反應管、毛細管或 96 孔的微量滴定板（按照不同的方法選用）

二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER

1.在 96 孔的微量滴定板上為每個反應集中如下的 PCR 組分。混合 HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。

2XHotStartMix                                                    25ul
引物 A                                                               0.1~ 0.5umol/L
引物 B                                                               0.1~ 0.5umol/L
探針或 SYBRGreen                                          0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                             3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                    10ul
水                                                                      補滿到 50ul

2.使用兩步（所有的 ABI7700TaqMan 定量分析）或三步 PCR。對于三步 PCR, 利用如下條件運行 40~50 個循環進行擴增。

 

對于兩步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火溫度到 60°C。
*取決于 HotStart 程序。

3.繼續進行下文步驟④的優化方案。

三、方法 B—SMARTCYCLER

1.在適當的管中為每個反應集中如下的 PCR 組分。混合 HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。

2XHotStartMix                                              2.5ul
引物 A                                                         0.3~0.8umol/L
引物 B                                                          0.3~0.8umol/L
探針或 SYBRGreen                                     0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                       3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                               5ul
水                                                                 補滿到 25ul

Smartcycler 要求使用的管子。

2.利用兩步或三步 PCR。對于三步 PCR，利用如下條件運行 40 個循環進行擴增。

 

對于兩步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火溫度到 60°C。
*取決于 HotStart 程序。

3.繼續進行下文步驟4的優化方案。

四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR

1.在適當的管中為每個反應集中如下的 PCR 組分。混合 HotStart 混合物和引物及探針/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 種 10 倍稀釋的模板 DNA。

2XFastStartMix                                              10ul
引物 A                                                            0.1~0.5umol/L
引物 B                                                            0.1~0.5umol/L
探針或 SYBRGreen*                                      0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                          3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                 5ul
水                                                                   補滿到 20ul

*LightCycler 要求使用毛細管。

2.利用三步 PCR, 如下條件運行 40(原文為 45—譯者改）個循環進行擴增。

 

3.繼續進行下文步驟④的優化方案。
優化定置分析的實用方法（見 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)

4.為了優化擴增子和引物，利用解鏈曲線功能分析實時 PCR 產物，此功能在 ABI770上不能直接獲得。對單個產物而言，結果應顯示其具有一個特異的解鏈峰，沒有表明形成引物二聚體的次級烽。當解鏈曲線數據以一階導數表示時將會是一單峰。多個峰表明有其他的擴增產物存在。如果檢測到多個峰，說明可能需要進一步優化鎂離子的濃度，但通常這表明需要重新設計引物。

5.為了優化探針，可利用靶分子的 1 倍稀釋液，選擇任意單位作標準曲線。例如假定DNA 的高濃度值是 107，由此它的 10 倍稀釋系列分別定為 107、106、105、104、103。鍵入這些數值作為起始量，在定量分析結束時用軟件作標準曲線。利用循環閾（Ct) 值和DNA 的起始濃度將可計算反應效率。

6.與常規 PCR 相似，需用一系列按 10 倍稀釋的標準液做進一步反應，以優化 MgCl2的濃度、引物濃度、探針濃度、退火溫度，以及調整 PCR 方案。

7.對于本身沒有快速循環操作方案的體系，可以嘗試進行更短的循環方案，以減少定量分析的時間。