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PI3K/Akt/mTOR信號通路
閱讀：817 發布時間：2019-3-28實驗方法原理 通過特異性阻斷PI3K和mTOR，觀察HepG2和Hep3B細胞株PI3K/Akt/mTOR信號通路活性及生物學行為的改變，探討相關的分子機制。
實驗材料 HepG2人肝癌細胞Hep3B人肝癌細胞株人正常肝細胞株QSG-7701
試劑、試劑盒 LY294002Rapamycin阿霉素
儀器、耗材 流式細胞儀熒光顯微鏡二氧化碳細胞培養箱酶標儀培養板蓋玻片載玻片
實驗步驟
一、細胞株表達情況監測
1. 在培養的HepG2、Hep3B人肝癌細胞株和人正常肝細胞株QSG-7701上，以免疫印跡方法（Western blot）檢測各細胞株中PI3K（p110α亞單位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表達情況。
2. 分別用 PI3K抑制劑LY294002（50 umol/ml）和mTOR抑制劑Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B細胞，以MTT比色法檢測細胞的增殖能力，以流式細胞術（Flow cytometry）檢測細胞周期和凋亡情況，以Western blot法檢測細胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表達改變。
二、細胞株表達結果
1. PTEN在HepG2和Hep3B細胞中基本無表達，在QSG-7701細胞株中高表達，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B細胞中的 表達較QSG-7701細胞均顯著升高。
2. LY294002和RAPA均呈劑量-時間依賴的抑制HepG2和Hep3B細胞生長。飽和效應濃度的 LY294002和RAPA作用24小時后，HepG2和Hep3B細胞均呈現明顯的G0/G1期阻滯，處于S期的細胞比例較對照組顯著減少 （P<0.01）。
3. 兩給藥組中HepG2細胞和Hep3B細胞的凋亡率與對照組比較均顯著增加（P<0.01）。
4. 兩給藥組HepG2細胞的凋 亡率顯著高于Hep3B細胞（P<0.01或P<0.05），并且HepG2細胞的凋亡率在RAPA給藥組顯著高于LY294002給藥組 （P<0.01），但Hep3B細胞的凋亡率在兩組間無顯著差異。
5. 飽和效應濃度的LY294002作用48小時后，HepG2和Hep3B細胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表達水平較對照組均顯著降低（P<0.01），飽和效應濃度的RAPA作用48小時后，HepG2和Hep3B細胞中P-mTOR（S2448）的表達水平較對照組均顯著降低（P<0.01），而pAkt（T308，S473）的 表達水平較對照組均顯著升高（分別P<0.01）。
三、結果分析
1. HepG2和Hep3B細胞存在PI3K/Akt/mTOR信號通路的組成性激活。
2. LY294002和RAPA能有效阻斷HepG2和 Hep3B細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制HCC細胞的生長增殖，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，且阻斷效應與HCC細胞P53的表達有 關。
3. 一定濃度范圍內，HepG2細胞對PI3K/Akt/mTOR信號通路阻斷劑的敏感性高于Hep3B細胞，RAPA對PI3K/Akt /mTOR信號通路的部分阻斷效應優于LY294002。
收起
其他
一、PI3K簡介
PI3K是細胞內重要的信號轉導分子，根據PI3K的P110亞基結構特點和底物分子不同可將其分為三大類，其中第Ⅰ類 PI3K 功能為重要，下面所述 PI3K 指的都是第Ⅰ類 PI3K。
PI3K主要由催化亞基 P110 和調節亞基 P85 組成。PI3K 可被生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號刺激激活。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，催化肌醇環上3位羥基生成3,4 二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate，PI-3,4P2)及 3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5P3)，它們均可作為第二信使在細胞中傳遞信號，介導 PI3K 的多種細胞功能，如這些脂質產物可通過與 Akt 的 PH(pleckstrin homology)區結合來激活Akt。腫瘤抑制基因pten(phosphatase and tensinhomologdelet-edonchromosometen)表達產物可誘導3磷酸肌醇去磷酸化，從而可對 PI3K 途徑進行負調節。
二、Akt簡介
Akt是一種Ser/Thr蛋白激酶。在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)的協同作用下，PI-3,4P2 和 PI-3,4,5P3 可與Akt結合，導致Akt從胞漿轉位到質膜，并促進 Akt 的 Ser473 和 Thr308 位點磷酸化。
Ser473或/和Thr308 位點的磷酸化是Akt激活的必要條件，而Akt激活是其發揮促細胞生存功能的重要前提。激活的 Akt 主要通過促進 Bad(Bcl-2 家族促凋亡成員之一)、mTOR、Caspase 3、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)等下游底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。
三、mTOR簡介
mTOR也被稱為FRAP(FKBP-rapamycin-associated protein)，屬于磷酸肌醇激酶3相關激酶(PIKKs)家族的一員，是PI3K/Akt的下游底物，可通過改變翻譯調節因子4E-BP1(真核細胞啟動因子4E結合蛋白)和 p70S6k的磷酸化狀態啟動翻譯過程。
去磷酸化狀態的4E-BP1能與翻譯起始因子eIF-4E結合，從而使后者喪失活性，而磷酸化的4E-BP1可解離釋放eIF-4E，從而使后者結合于 mRNA 5'端起始點啟動翻譯過程。p70S6k磷酸化可通過促使40S核糖體蛋白S6磷酸化而啟動翻譯。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在正常和腫瘤細胞的增殖和生存中具有重要作用，以抑制mTOR為主要作用原理的抗腫瘤藥物已經進入臨床開發的早期階段。