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細(xì)胞凋亡檢測實驗之DNA 斷化檢測
閱讀：1277 發(fā)布時間：2019-3-19實驗方法原理 細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300 kbp 長的DNA 大片段, 或180~200 bp 整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA 后，用32P-ATP 和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA 標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder 的形成。
實驗步驟
一、大分子染色體DNA 段的測定
細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300 kbp 長的DNA 大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA 的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達(dá)到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA 像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300 kbp 長的DNA 大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當(dāng)DNA 分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA 就可以按其分子量大小分開。
二、DNA Ladder 測定
細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。（來源：免疫學(xué)實習(xí)指導(dǎo)——北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系）
收獲細(xì)胞（1X107）沉淀?細(xì)胞裂解液13000 rpm′5 min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5 mg/ml）56 °C，2 h。蛋白酶K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h，1/10 體積3 M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4 °C過夜。14000 rpm′15 min后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer 1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。
三、凋亡細(xì)胞DNA 含量的流式細(xì)胞計分析
收集細(xì)胞，70 %冷乙醇（in PBS）4 °C 固定過夜，PBS 洗滌，1000 rpm′10 minRNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化30 min PI（50 mg/ml）染色，室溫避光15 min，F(xiàn)ACScan 分析DNA 亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。
四、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測。