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離子交換層析法蛋白質(zhì)的純化實(shí)驗(yàn)
閱讀：1856 發(fā)布時間：2019-3-18離子交換層析在純化蛋白質(zhì)的層析手段中使用為廣泛。它對蛋白質(zhì)的分辨率高，操作簡易，重復(fù)性好，成本低。按照離子交換原理，蛋白質(zhì)可從大量緩沖性溶液中被分離，所以此方法尤適于蛋白質(zhì)粗提物的初始純化。在分離蛋白質(zhì)時，速度往往是很重要的。 如蛋白酶的初始分離和不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的純化。離子交換層析提供了很多加速分離的手段。這些特點(diǎn)使離子交換層析成為價值的蛋白質(zhì)純化手段和設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)純化方案時可行性很強(qiáng)的出發(fā)點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法原理
可進(jìn)行離子交換的蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)條件下必須有單一電荷。溶液中單一電荷的蛋白質(zhì)可被離子交換樹脂上的小離子置換（指與蛋白質(zhì)末端離子的交換）；固定在樹脂上。通過提高溶液中相反離子濃度或降低蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)等方法可將蛋白質(zhì)從樹脂上洗脫下來。利用此法，可根據(jù)不同蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)不同而將其分離開來。
若已知蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分離的起姶策略就很容易制定了。如果是未知蛋白質(zhì)，通過離子交換預(yù)實(shí)驗(yàn)可得到很多關(guān)于蛋白質(zhì)的生物物理信息并指導(dǎo)進(jìn)一步的純化處理。
實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)溶液
儀器、耗材 離子交換層析系統(tǒng)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 離子交換樹脂的選擇
陰離子交換樹脂用于處理凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)；陽離子交換樹脂用于處理凈電荷為正的蛋白質(zhì)。DEAD 或 CM-Sepharose 等瓊脂基的樹脂對很多蛋白質(zhì)都是適用的。
1.1 離子交換樹脂的類型
離子交換樹脂除了以陰、陽分類外，還分為強(qiáng)離子交換樹脂和弱離子交換樹脂。強(qiáng)離子交換樹脂在大部分 pH 范圍內(nèi)離子化程度都很高，弱離子交換樹脂在工作 pH 值時離子化程度則很低。強(qiáng)離子交換樹脂用于離子交換中液相 pH 值很高或很低的情況。過去大多數(shù)層析試驗(yàn)都是用弱離子交換樹脂進(jìn)行的，但強(qiáng)離子交換樹脂能提供更好的重現(xiàn)性。
一個重要的離子交換樹脂是羥基磷灰石。它使用磷酸鈣結(jié)晶作為離子交換劑，可處理酸性和堿性蛋白質(zhì)。
1.2 層析速度
樹脂的形態(tài)應(yīng)使層析時液相流動速度適中，讓蛋白質(zhì)有足夠的時間吸附在樹脂上過髙的層析速度雖然可節(jié)約時間，但也會降低試驗(yàn)精度。
1.3 樹脂吸附容量
樹脂吸附容量是評估某種樹脂處理蛋白質(zhì)量的一種標(biāo)準(zhǔn)，其單位是毫克蛋白質(zhì)/毫升樹脂。可由它決定層析時使用樹脂量。在高精度層析時只使用樹脂高吸附容量的 10％～20％。同樣的樹脂其吸附容量對于高分子量蛋白質(zhì)要比對于低分子置蛋白質(zhì)低，這是因?yàn)榈头肿恿康鞍踪|(zhì)與樹脂的結(jié)合點(diǎn)更多。
1.4 樹脂的溶脹
Sephadex 等一些材料會被高壓所壓縮，或在離子條件改變時膨脹或萎縮。這樣的樹脂需要再生。樹脂的膨脹會使層析柱的處理復(fù)雜化。新的樹脂材料大多數(shù)已克服了這一問題。
1.5 對 pH 值的穩(wěn)定性
如果實(shí)驗(yàn)中 pH 值很低或很高，樹脂一定要具有與之相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。而且此時弱離子交換樹脂的離子化程度會很小，應(yīng)選用強(qiáng)離子交換樹脂。
2. 樹脂的準(zhǔn)備和層析柱的填裝
層析柱的準(zhǔn)備可分三個步驟：（1）使干燥的樹脂溶脹；（2）將樹脂裝入柱中；（3）用無蛋白質(zhì)的樣品緩沖液浸泡樹脂達(dá)到交換平衡。為保持蛋白質(zhì)的活性，試驗(yàn)可在 4℃ 下進(jìn)行，此時所有設(shè)備和試劑均應(yīng)冷卻至 4℃，并于此溫度儲藏。
2.1 使樹脂溶脹
商品樹脂為干燥的粉末，必須用樣品緩沖液浸泡使之溶脹，1 g 樹脂在溶脹后體積可達(dá) 5～50 ml。
2.1.1 將干燥樹脂以大約十倍體積量的樣品緩沖液浸泡（如 10 g 樹脂＋100 ml 樣品緩沖液）。
2.1.2 煮沸 1 h 以上或浸泡若干小時至若干天，使樹脂充分濕潤。煮沸時適量多加入樣品緩沖液，保證上樣緩沖液不被煮干。
2.1.3 在溶脹過程中攪拌幾次，保證樹脂充分浸潤。
2.1.4 溶脹過程中更換幾次樣品緩沖液，使交換到樹脂內(nèi)的成分與樣品緩沖液成分差別不大。溶脹過程中不要使用攪拌磁子，它會將樹脂打成小碎片。
2.2 將樹脂裝柱
在裝柱之前，樹脂即須用樣品緩沖液浸泡以達(dá)平衡。浸洗樹脂有時需要數(shù)十倍于柱體積的樣品緩沖液，這樣可以節(jié)約大量時間。裝柱用的樹脂凝膠應(yīng)為一份體積干樹脂與一份體積樣品緩沖液的混合物。高精度層析時柱高應(yīng)為柱直徑的 4～5 倍，對一般層析而言，柱高只需為柱直徑的 2 倍。在裝柱時一定要非常謹(jǐn)慎。裝柱必須一次性完成，否則會嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)分離的精度與重現(xiàn)性。一個樹脂儲存器可以提供足夠一次性裝柱的樹脂量（見圖 1）。
圖 1 樹脂存儲器
2.2.1 在燒杯中用樣品緩沖液浸洗樹脂。攪拌 1 min， 測量 pH 值。若 pH 值與原樣品緩沖液不同，傾瀉掉大部分樣品緩沖液，加入新樣品緩沖液，重新攪拌和測量 pH 值。這一步驟叫部分平衡，它可以減少樹脂在層析柱中正式平衡的時間；
2.2.2 若在室溫下進(jìn)行層析，將樹脂真空抽氣 1 h 以除去其中的小氣泡，抽氣時搖動層析柱有助于氣泡的趕出；
2.2.3 在層析柱中加入少量樣品緩沖液；
2.2.4 打開層析柱出口，導(dǎo)出少量上樣緩沖液以趕出層析柱底部的空氣；
2.2.5 搖勻樹脂，用一根玻璃棒將其導(dǎo)入層析柱，不要帶入氣泡；
2.2.6 打開層析柱出口，在樹脂堆積時加入更多的樣品緩沖液；
2.2.7 可用一個適配器進(jìn)行裝柱。確定沒有氣泡進(jìn)入柱中，它們會影響層析速度，甚至使層析停止；
裝拄時，長層析柱可稍微傾斜。值得注意的是。一些樹脂慢速裝柱的效果比較好，這樣的樹脂有葡聚糖凝膠樹脂等；而另一些樹脂，如瓊脂凝膠樹脂，快速裝柱。
2.3 使樹脂達(dá)到交換平衡
裝柱之后，用樣品緩沖液終潤洗樹脂，便其 pH 值和離子強(qiáng)度終達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，并將樹脂洗到基線水平。在這一步中使用的樣品緩沖液一般不超過樹脂體積的 10 倍。將樣品緩沖液的 pH 值和電導(dǎo)率與洗脫液進(jìn)行比較，確保樹脂已達(dá)到平衡。
3. 樣品上柱
3.1 樣品的準(zhǔn)備
樣品溶液首先要通過離心分離或用 0.45 um 孔徑濾紙過濾而成為澄清溶液。注意不要在這一過程中使目的蛋白損失。溶解蛋白質(zhì)的樣品緩沖液離子強(qiáng)度低于 50 mmol/L 可用凝膠過濾法、透析法或超濾法達(dá)到此目的。稀釋蛋白質(zhì)溶液也是可供選擇的一個方法。
3.2 進(jìn)樣
3.2.1 打開層析柱底部出口，將上樣緩沖液引入柱中，直至液面達(dá)到樹脂表面。關(guān)閉層析柱底部出口；
3.2.2 用移液管將蛋白質(zhì)溶液緩慢的加在樹脂面上；
3.2.3 打開層析柱的出口，讓蛋白質(zhì)溶液進(jìn)入樹脂，當(dāng)溶液表面與樹脂表面重合時，關(guān)上層析柱的出口；
3.2.4 在樹脂表面緩慢的滴加少許上樣緩沖液；
3.2.5 重復(fù)步驟 3.2.3 的操作；
3.2.6 重復(fù)步驟 3.2.4 的操作，并將層析柱掛起；
3.2.7 之后就可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的層析和洗脫了。
4. 洗柱和目的蛋白的洗脫
在洗脫任何結(jié)合蛋白質(zhì)之前，使樣品緩沖液持續(xù)流過離子交換樹脂柱，可帶走不與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)，使之與吸附在樹脂上的蛋白質(zhì)分離。這一步驟一般要使用 3～10 倍于樹脂體積的樣品緩沖液。檢測流出液的蛋白質(zhì)濃度或光密度是必要的。當(dāng)有微量蛋白質(zhì)出現(xiàn)時，蛋白質(zhì)的洗脫就應(yīng)開始了。
如前所述，蛋白質(zhì)的洗脫分為步進(jìn)洗脫和梯度洗脫。步進(jìn)洗脫時，每一階段離子強(qiáng)度的增加不必一致，如用 NaCl 溶液洗脫時，可分三步洗脫，NaCl 濃度依次為：0.1 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L（見圖 ２）。梯度洗脫時洗脫液的離子強(qiáng)度是逐漸增加的，如將洗脫液中的 NaCl 濃度從 0.02 mol/L逐漸增加到 1.0 mol/L（見圖 ３）。梯度洗脫可便不同蛋白質(zhì)的分離更沏底，而分步梯度洗脫可簡化步驟；加快速度。但分步梯度洗脫離子強(qiáng)度變化過大時，一些蛋白質(zhì)將無法分離。進(jìn)行的蛋白質(zhì)分離或兩種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相近時，梯度洗脫是必要的。步進(jìn)洗脫可在預(yù)試驗(yàn)或目的蛋白洗出后采用。
4.1 步進(jìn)式洗脫（圖 ２）
4.1.1 在層析拄中通過 3～10 倍于樹脂體積的洗脫液（如 20 mmoo/L Tris－HCl、0.1 mol/L NaCl 溶液）。
4.1.2 使洗脫液面與樹脂床面平齊，這樣可以保證在加入不同濃度的洗脫液時 NaCl 濃度的變化不出現(xiàn)偏差。
4.1.3 將洗脫液換為第二種濃度；重復(fù) 4.1.1、4.1.2 步橾作。
圖 1 步進(jìn)式洗脫的洗脫液吸光曲線
4.2 梯度式洗脫
梯度式洗脫的洗柱緩沖液總用量應(yīng)為樹脂床體積的 5～10倍。
4.2.1 將離子強(qiáng)度較低的洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl,0.02 mol/L NaCl） 放在梯度儀離層析柱較近的一端，離子強(qiáng)度較高的洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl，1.0 mol/L NaCl） 放在另一端。裝洗脫液的兩個容器應(yīng)該一樣，溶器中的液面高度也須相同。確保梯度儀中沒有氣泡。開動低濃度洗脫液容器中的電磁攪拌器，將梯度儀裝在層析柱上。
4.2.2 用部分收集器收集洗脫液并檢測其成分。
圖 ３ 梯度式洗脫的洗脫液吸光曲線