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初代細胞培養實驗
閱讀：825 發布時間：2019-2-27初代培養或原代培養，可以用于：（1）從供體獲取組織后的培養；（2）組織和細胞剛剛離體，生物性狀尚未發生很大的變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、生物條件穩定的情況下（年齡、性別），在一定程度上能反映體內狀態。
實驗方法原理合成培養基胰蛋白酶消化培養法，能把組織塊分散成細胞團或單個細胞，便于細胞從培養液中攝取營養和排出代謝產物，細胞能較快地長成單層。
本法尤適用于培養大量組織，細胞產量高；但用于經常性小量培養工作稍顯繁瑣，無菌操作不良時且易污染。
實驗材料組織
試劑、試劑盒Hanks培養液胰蛋白酶
儀器、耗材吸管平皿培養瓶燒杯攪拌器三角燒瓶不銹鋼篩眼科剪眼科鑷計數板
實驗步驟
1. 準備
取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20 分鐘；
2. 布局
點燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應通過火焰）；
3. 處理組織
把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；
4. 剪切
用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞；
5. 消化
或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好（消化前瓶中需置一無菌攪棒）；消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定；
6. 分離
在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時可繼續進行消化）；低速（500~1000 轉/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養液）；
7. 計數
用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中；對大多數細胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO3調整；
8. 培養
置入36.5 ℃溫箱培養；如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。
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注意事項
組織塊、胰蛋白酶、培養液等易受紫外線傷害的物品，在培養時再攜入操作野；如預先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作時宜挽上袖口）。
其他
常用的初代培養有組織塊培養和分散細胞培養。組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基后進行培養。分散細胞培養則是將組織塊用機械法或化學法使細胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性的游離細胞，經典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細胞間的結合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細胞互相粘著所依賴的Ca2＋，再經機械輕度振蕩，使之成為單細胞。
參考《組織培養和分子細胞學技術》北京出版社
實驗材料組織
試劑、試劑盒Hanks培養液胰蛋白酶NaHCO3
儀器、耗材吸管培養瓶燒杯眼科剪眼科鑷
實驗步驟
1. 剪切
把組織小塊（1cm3）置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂液二三次以去掉表面血污，吸凈Hanks液，用眼科剪反復剪切成1mm3塊為止；
2. 擺布
用彎頭吸管吸取若干小塊，置入培養瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶底上，小塊相互距離以0.5 cm 為宜，每一25 ml培養瓶底可擺布20~30 塊；
3. 輕輕翻轉培養瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5 ℃溫箱2 小時左右（勿超過4 小時），使小塊微干涸；
4. 培養
從溫臬中取出培養瓶，開塞，46 度斜持培養瓶（瓶底仍向上），向瓶底角部輕輕注入培養液小許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過來，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊（組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走）；置溫箱中靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后，再補加培養液。
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其他
一、評價
翻轉培養瓶的目的是為使組織塊微干涸，以利附和免從瓶壁流失，但時間不宜過長，超過三四小時以上可能對組織有不利影響。
組織塊培養法操作簡便，順利情況下，組織小塊貼壁培養后24 小時，細胞即可從小塊邊緣向四周游出，通過生長增殖，終亦可連接成片；原組織小塊可*散成細胞而消失。如組織塊過大，殘留小塊換液時棄掉或再置另瓶中繼續培養。
組織塊通過反復剪切可能受一定損傷，并非每塊組織都有生長能力，但只要有一部分能生長往往即可形成單層。