化工儀器網
技術文章
新生大鼠心臟細胞的分離和培養實驗
閱讀：331 發布時間：2018-12-29實驗材料 Sprague Dawley 幼鼠
試劑、試劑盒 胰酶液乙醇
儀器、耗材 攪拌臺燒杯
實驗步驟
組織消化和分離細胞
1. 在細胞操作間內，放一個加熱攪拌臺，上放一個裝有 100 ml 滅菌水的容量 600 ml 的燒杯，加熱至 37℃。
2. 準備胰酶液。用水浴或溫箱使胰酶液溫度保持在 37℃。
3. 做一個冰臺：將一只平皿裝滿冰后倒置即可，70% 乙醇擦拭平皿后放進操作臺。取 3 個 60 mm 的一次性組織培養用平皿，加入 5 ml 鹽水 A，標記上 1，2,3 放進操作臺的冰臺上。
4. 取一只干凈加蓋的燒杯，內放一塊 Metofane 飽和的紗布，把 0~1 日齡的 Sprague Dawley 幼鼠放進該燒杯中麻醉。20 只 幼鼠大約需要 5 分鐘時間。用 70% 乙醇擦凈燒杯再放進操作間。
5. 一次取出一只幼鼠，一定要再蓋好蓋子，然后將幼鼠躺著放在一塊無菌紗布上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。把鼠肩胛骨往后夾，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心臟放進標記著 1 的培養皿中。
6. 繼續處理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械潔凈，每次解剖約需 1 分鐘。
7. 上述操作完成后，用兩把 5 號鉗子剔除心臟上結締組織再轉入標記為 2 的培養皿中。再洗一遍，轉入標記為 3 平皿中。
8. 取一只無菌巴斯德吸管輕輕把平皿 3 中的鹽水液 A 吸出，然后加入 2 ml 孵育過的胰酶液。用準備好的第二把無菌解剖刀把心臟切碎成沙粒大小。
9. 把上述切碎的心臟及胰酶液轉入加了攪拌子的錐形瓶中。另外吸取 3 ml 新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉入錐形瓶，補加胰酶至終體積 10 ml，加上塞子，放入 37℃ 水浴中。打開攪拌器，調節轉速至 60 r/min 左右，消化 15 分鐘。
10. 從水浴中拿出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞，加入 10 ml 新的胰酶，37℃ 水浴再作用 15 分鐘。
11. 棄上清。加入 10 ml 新的胰酶，用一支一次性帶刻度的吸管吹打溶液兩次，機械分散細胞，再孵育 10 分鐘。
12. 上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌錐形管中加入 10 ml 冷的接種培養基。
培養已分離出的細胞
13. 消化處理之后，小心移出上清至上述加有接種培養基的錐形管中，這就是次收集到的分離出的細胞。余下的組織塊中加入 10 ml 新胰酶繼續消化。
14. 消化的同時，上述含培養基和細胞上清的錐形管以 1200 r/min 離心 4 分鐘。輕輕吸去上清，加 5 ml 接種培養基重新懸浮細胞團。
15. 重復 11~14 步驟 9 次，或直至只剩余少許組織塊為止。將所用細胞懸液集中于一支錐形管中。
16. 后一次沉淀細胞，加接種培養基至 10 ml，吹打幾次以散開所有細胞團。
17. 將上述 10 ml 懸液轉移到 100 mm 規格的無菌組織培養平皿中，于 5% CO2，高濕度的 37℃ 溫箱中放置 1~1.5 小時，目的是減少成纖維細胞的污染。
18. 孵育后，收集所有平皿中的培養液，培養液中包含非貼壁細胞，每個平皿用 10 ml 預溫的接種培養液沖刷后收集。量一量后收集溶液的體積，用臺盼藍拒染法計數細胞。一般地，總細胞數在 5X107~1X108 間，成活率約 85%。
19. 用接種培養基將細胞密度調整至 5X105~6X105 細胞/ml，制成接種液。
20. 每只 35 mm 規格平皿加 2 ml 上述接種液，60 mm 規格的平皿加 5 ml 的接種液，孵育 4~6 小時。
21. 4~6 小時后，用培養基或鹽水液 A 輕輕洗涮平皿兩次，倒掉，加入交換培養基繼續孵育過夜。
22. 用培養基或鹽水 A 沖洗平皿兩次，加入新配制的交換培養基，繼續溫育，兩天換一次液。