化工儀器網
技術文章
胰島素受體對胰島素親和性的測定實驗
閱讀：457 發布時間：2018-12-28本實驗介紹胰島素受體對胰島素親和性的測定方法。本實驗來源于蛋白質純化與鑒定實驗指南
實驗步驟
材料
[125I]胰島素（受體級）（DuPontNENNEX196)
豬胰島素（如，Sigma Chemical Co,I3505)
牛血淸白蛋白（BSA;1%)
試劑
結合緩沖液（冷配體置換實驗用)
(配方，見“試劑的配制”，PP.234~240)
操作程序
1)于微量離心管中建立下列反應體系：
2)各離心管置搖床上，室溫下孵育2h。
3)各管用微型離心機離心20min,去上清。
4)用γ-計數器計數離心管內的放射性強度。分別從第1至6管的cpm值中減去第7管的cpm值（非特異性cpm值和本底cpm值)，得特異結合的cpm值。
5)將各管的特異性結合cpm值除以總cpm值，得與膜結合的那部分胰島素所占的份額。該值乘以各管中的胰島素濃度，即得配體-受體復合物的濃度（[HR]，亦稱[B],它表示結合的配體)。
6)從管中的胰島素濃度減去[HR],得游離配體的濃度（[H],亦稱[F],它表示游離的配體)。
7)至此，可用幾種方法分析所得的結果。如能用計算機程序，將數據直接代入下式則更好：
也可通過[HR]對log([H])作圖來分析這些數據。此圖應給出S型曲線。于是，可分別從[HR]的大值和曲線的拐點得出受體總數和KD值（Klotz,1982)。第三種方法是用斯卡査德（Scatchard)圖分析數據，斯卡査德圖就是所作的圖。若只有一種類型的結合位點,則斯卡査德圖為一直線。為作斯卡査德圖，先要確定對應于每個[H]的[HR]/[H]值，然后以[HR]/[H]值對[HR]作圖,此線的斜率為-1/KD，橫坐標的截距力受體總數([R]t)。若有多于一種類型的結合位點,且有不同的親和性時，斯卡査德圖將是一條曲線而不是直線。