化工儀器網
技術文章
成年大鼠心室肌肉細胞的分離和培養實驗
閱讀：480 發布時間：2018-12-19實驗材料 鼠
試劑、試劑盒 KH 緩沖液混合氣體
儀器、耗材 對流工作臺或層流式超凈臺罩冷凝器循環水浴和水浴搖床圈型架蠕動泵臺式醫用離心機無菌燒杯ColorpHast pH 試紙
實驗步驟
一、ARVM 細胞分離的準備工作
1. 準備如下設備及器材：
對流工作臺或層流式超凈臺
罩
冷凝器
循環水浴和水浴搖床
帶夾的圈型架
免蠕動泵
臺式醫用離心機
95% O2 5% CO2 混合氣體
400 ml 無菌燒杯
ColorpHast pH 試紙（精密型）
2. 在對流式或層流式工作臺中，裝配 Langedorff 系統，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動泵。冷凝器連接 37℃ 循環水浴，這樣溫水從冷凝器底部流進從頂部流回水浴。
3. 在工作臺的無菌區域，布置下列無菌器械，這些可以是高壓滅菌過的或一次性無菌器材：
組織鉗
大號剪刀
彎頭小夾子 2 個
小剪刀
蚊式止血鉗
Swinnex 25 mm 規格的濾器支架
250 ml 燒杯
玻璃管和硅膠管
帶螺蓋的，50 ml 錐形瓶，內加小攪拌棒
帶螺蓋的 250 ml 錐形瓶
一次性培養皿，吸管，60 ml 注射器，15 ml 和 50 ml 離心管，縫合線
4. 準備加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit（KH）培養基，過濾除菌 37℃ 保溫。
5. 充氧飽和 KH 緩沖液和無鈣 KH 培養基直到 pH 值約 7.4。轉移 150 ml 氧飽和的無鈣 KH 緩沖液至無菌的 250 ml 帶螺帽錐形瓶中并置于 37℃ 水浴。螺帽務必蓋好。
6. 制備酶溶液Ⅰ。裝有氧飽和的無鈣 KH 緩沖液的錐形瓶中加 75 mg 的膠原酶和 45 mg 的透明質酸酶。
7. 制備酶溶液Ⅱ。取 21 ml 溶液Ⅰ轉移至一支新管中，加 2 ml 胰酶和 20 μl 無菌 1 mol/L CaCl2 過濾除菌。膠原酶/透明質酸酶溶液移至一無菌的 250 ml 的帶螺帽錐形瓶中，膠原酶/透明質酸酶/胰酶液移至一無菌的 50 ml 帶螺帽錐形瓶中。
8. 往個 250 ml 燒杯中加 150 ml KH 緩沖液，并加入灌注系統，避免產生氣泡。在插管處檢查流過液的 pH 值，通以 95% O2/5%CO2 氣體將 pH 值調回 7.4。流出液體回收到無菌 400 ml 燒杯中。
9. 用預溫的 KH 緩沖液覆蓋整個平皿底。
10. 把只鼠放進罩中麻醉。
11. 把充過氧的無鈣 KH 緩沖液放進第二只 250 ml 無菌燒杯中，將流速調高至 5.5 ml/min，灌注 6 分鐘。
12. 酶溶液Ⅰ放進第三只 250 ml 燒杯中，泵速度調節至 8 ml/min，灌注 5 分鐘。把該 250 ml 燒杯放在心臟下面繼續重新灌注心臟 15 分鐘以上。
二、解剖動物和灌注心臟
1. 動物*麻醉后，放在 Langendorff 裝置的附近。動物平躺放置，用乙醇浸潤胸部剪開胸部皮毛。
2. 用大剪刀在肋骨下切一橫向切口打開胸腔，然后切開胸膈膜。
3. 提起劍突，胸中線兩邊約 2 cm 處沿肋骨各做一條徑向切口，千萬不要觸及心臟。
4. 用夾子掂起心臟，剪斷下方的連接，摘下心臟和胸腺，摘下的心臟放在裝有 KH 溶液的佩特里氏平皿，然后轉到支著灌注設備的工作臺上。
5. 把心臟移到平皿的邊緣，提起胸腺露出主動脈，用小剪刀剪掉胸腺。
6. 打開泵，流速調至約每秒一滴。雙手穩握兩把小鉗子，使主動脈沿插套滑動至插套管底部位于心臟的頂部。
7. 用蚊式止血鉗固定住心臟，鉗子夾著主動脈底部并保證止血鉗夾著主動脈上端。
8. 在止血鉗下部，用縫合線牢固地綁住心臟，灌注 3~5 分鐘使心臟血*排出。
9. 從心臟上剔除殘余組織，保持肺動脈以及動脈附屬件的完整性。
三、心臟組織的消化
1. 酶溶液Ⅰ進行灌注的后 2 分鐘時，用 colorp Hast 試紙檢查液體的 pH 值，若有必要，通氣調節 pH 至 7.4。
2. 從插套管上割下心室并仔細切成 1 mm2 的小塊。轉入裝有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 錐形瓶中，于 37℃ 水浴，100 r/min 搖動孵育 15 分鐘。
3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述樣品后轉入一支 50 ml 錐形離心管中加 20 ml 洗滌培養基。
4. 一支 60 ml 注射器，拿掉推桿，裝上 Swinnex 濾器。往針筒內加入細胞懸液，把細胞過濾到一支新管中。
5. 500 r/min（50 g）離心 30 秒，去上清后，細胞重新溶于 10 ml 新的洗滌培養基中。
6. 讓梭形細胞沉降 20 分鐘，小心去上清，用 10 ml 新洗滌培養基重懸細胞。
7. 讓細胞沉降 15 分鐘，去上清，用 10 ml 洗滌培養基重懸細胞。
8. 重復上述洗滌步驟，共洗 4 次，后一次洗滌后，倒去上清。加入 5 ml 洗滌培養基。
9. 重懸細胞后小心鋪放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上層，讓梭形細胞沉降 10~15 分鐘。
10. 后的細胞團應包含高比例的活的梭形心室心臟細胞。每只心臟若能收到 3X106 個細胞就很不錯了。
四、ARVM 細胞的培養
1. 在上述細胞洗滌的同時，準備包被平板/蓋玻片/載玻片于室溫，用 10 μg/ml 層黏素溶液浸沒 30 分鐘。
2. 加入適量的培養皿重懸后所得的細胞團，并以每只 100 mm 規格平皿 1X106 個細胞的量接種至已包被過的平板上。
3. 讓細胞貼壁 1 小時，然后換新的培養基連續孵育。用加血清或不加血清的培養基繼續培養 1 或 2 周。
4. 細胞隔天換液。