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骨髓造血細胞的長期培養
閱讀：354 發布時間：2018-12-18骨髓造血細胞的長期培養
實驗方法原理 將骨髓吸入培養液。作為附著的多層細胞，骨髓至少維持 12 周，可達 30 周。干細胞、趨向成熟的骨髓細胞和成熟骨髓細胞從附著的細胞層釋放入培養液。粒細胞或巨噬細胞的祖細胞可用軟凝膠培養檢測。
實驗材料 小鼠
試劑、試劑盒 Fischer培養液生長培養液
儀器、耗材 注射器紗布拭子解剖剪解剖鑷培養瓶
實驗步驟
1. 斷頸處死小鼠（ 5 只小鼠：（C57BI/6×DBA/2）F1 骨髓的長期培養效果好，但一些種系的骨髓的培養效果不佳，如 CBA [ Greenberger，1980 ]）。
2. 用 70 % 乙醇泡濕毛發，切除兩側股骨。將 10 塊股骨放人盛有 Fischer 培養液（含有 16 mmol/L（1.32 g/L）NaHCO3，添加50 U/ml 青霉素和 50 μg/ml 鏈霉素）的 Petri 培養皿內，培養皿放在冰上。1 塊股骨含有 1.5×107~2.0×107 個有核細胞。
3. 在層流超凈工作臺操作：
(a)用紗布和拭子清除剩余的肌組織。
(b)用解剖鑷固定股骨，切斷膝關節端。21G 針頭應能緊緊地插人骨髓腔。
(c)切斷股骨的另一端，盡量靠近末端。
(d)將股骨的一端插入盛有生長培養液的 100 ml 瓶內，抽出和推壓注射器活塞數次，直至將股骨內的骨髓沖洗出來。
(e)重復操作步驟 (a)~(d)，取出另外 9 塊股骨內的骨髓。
4. 用 10 ml 吸管吹打大的骨髓團塊，使骨髓分散成細胞懸液。
5. 按 10 ml 等量將細胞懸液分放入 25 cm2 培養瓶。不斷搖晃細胞懸液，以便保證將細胞均勻地分到 10 個培養瓶中。
6. 向培養瓶中充入 5 % CO2，然后擰緊蓋。
7. 在 33°C 條件下，橫置培養瓶，培養細胞。
8. 每周換液 1 次。
(a)輕輕搖晃培養瓶，使附著不牢固的細胞懸起。
(b)吸去 5 ml 含有懸浮細胞的培養液。注意吸管不要觸到附著細胞層。
(c)向每個培養瓶中加入 5 ml 生長培養液（生長培養液：分裝為 100 ml。Fischer 培養液，添加 1×10-6 mol/L 和丁二酸鈉以及 20 % 馬血清。將和丁二酸鈉用 Fischer 培養液配制成儲存液，在 -20°C 條件下儲藏）。不要將培養液直接加在附著細胞層上，以免損傷細胞。
(d)向培養瓶中充入氣體后，放入培養箱。