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WB操作規程
閱讀：534 發布時間：2018-9-28一、設備和試劑
1．設備
① 電泳電源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 電泳儀及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 電轉儀及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE，Catalog#88018
⑤ 濾紙
Whatman,3MM CHR
2.試劑
① 凝膠試劑
試劑名稱 廠家及規格
30%丙烯酰胺溶液 上海生工
Tris-Base SIGMA
10%SDS SIGMA
10%過硫酸銨 上海生工
TEMED 上海生工
② 常用溶液及緩沖液
A．5%積層膠所用溶液
B．分離膠溶液
C．電泳緩沖液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸餾水至IL，pH應該在8.3左右。也可以制成10×的儲存液，在室溫下長期保存
D．電泳轉移緩沖液,1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸餾水至1L, 也可以制成10×的儲存液，在濕溫下長期保存
E．5×樣品緩沖液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巰基乙醇、1ml 1%溴酚藍，0.9ml的蒸餾水，可在4℃保存數周，或在-20℃保存數月。
③ 二抗稀釋液
AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562;
AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422
一般采取1:3000-1:5000的稀釋度，用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀釋
④ 顯色底物緩沖液
A.HRP標記二抗底物緩沖液
DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）, Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光，混勻
B.AKP標記二抗底物緩沖液
AKP緩沖液：
0.1mol/L Tris-HCL（PH9.5）, 0.1mol/L NaCL, 5mmol/L MgCL2
BCIP溶液/NBT溶液：
50mg/ml BCIP溶于100%二甲基甲酰胺
50mg/ml BCIP溶于70%二甲基甲酰胺
⑤ 其他試劑
A． 考馬斯亮藍染液，1L
考馬斯亮藍R-250 1.0g、甲醇 450ml、冰醋酸 100ml
B． 考馬斯亮藍脫色液
甲醇 100ml、冰醋酸 100ml、蒸餾水800ml
二、方法
1．Bio-Rad微型凝膠電泳模具的安裝
帶上手套將凝膠電泳系統的前后玻璃板，梳子用去污劑洗滌，后再用去離子水沖洗干凈，除去黏附在玻璃板上凝固的膠和其他污垢。晾干玻璃板或用電吹風吹干。將玻璃板的橡膠墊條用吸水紙吸干，然后按Bio-Rad Mini-Protean電泳系統的使用說明書安裝好玻璃板，固定于制膠板上。
2．SDS-PAGE凝膠的配制
① 根據實驗檢測抗原的分子量大小選擇合適的電泳分離膠濃度。確定分離膠所需凝膠溶液體積（這些數據一般由廠家提供，例如Bio-Rad Mini-Protean 3 Elecreophoresis Cel 83mm×75mm×0.75mm,兩塊膠需8ml）
按下表給出數據在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配置一定體積的分離膠溶液。依次混合各成分。
10ml分離膠各成分所需體積（ml）
濃度
溶液成分 8% 12% 15%
水 4.6 3.3 2.3
30%丙烯酰胺 2.7 4.0 5.0
1.5mol/L Tris(pH8.8) 2.5 2.5 2.5
10%SDS 0.1 0.1 0.1
10%過硫酸銨 0.1 0.1 0.1
TEMED 0.006 0.004 0.004
一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。
② 迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，不能有氣泡，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長再加1cm）。然后小心的在分離膠溶液上覆蓋一層1-5mm的水層，這使凝膠表面變的平整。
③ 等待30-60min，使凝膠聚合。當凝膠聚合后，在分離膠和水層之間會出現一個清晰的界面，可以微微傾斜模具，檢測凝膠是否聚合。用去離子水洗滌凝膠頂部數次以除去未聚合的凝膠，盡可能排去凝膠上的液體，再用濾紙吸凈殘留液體，注意不要接觸膠面。
④ 按下法制備積層膠：按下表給出數據在一個干凈的試管或小燒杯中制備一定體積濃度為5%的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。（兩塊5%積層膠Bio-Rad Mini-Protean 83mm×75mm×0.75mm, 兩塊膠需3ml）
不同體積積層膠各成分所需體積（ml）
體積
溶液成分 2 3 5
水 1.4 2.1 3.4
30%丙烯酰胺 0.33 0.5 0.83
1mol/L Tris(pH6.8) 0.25 0.38 0.63
10%SDS 0.02 0.01 0.05
10%過硫酸銨 0.02 0.03 0.05
TEMED 0.002 0.003 0.005
一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下一步操作。
⑤ 在已聚合的分離膠上直接灌注積層液。立即在積層膠溶液中插入干凈的實驗預設計的梳子，小心避免混入氣泡，將凝膠垂直放置于室溫下。
⑥ 積層膠聚合*后（30min）,小心移出梳子，使用洗瓶立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。
3．SDS-PAGE電泳
① 將抗原（細胞裂解液、重組蛋白）樣品置于凝膠加樣緩沖液中，在100℃加熱三分鐘以使蛋白質變性。
② 設計加樣順序，作好實驗記錄，按預定順序加樣。一般每個電泳道加樣大體積為25µl,每個電泳道上樣的低蛋白質量（每一條蛋白質條帶）：0.1µg（考馬斯亮藍染色）-2ng（銀染色）,高蛋白質量（蛋白質混合物）：20-40µg。
③ 把電泳裝置與電源連接好，將電壓調至200V，電流應流向陽極，待溴酚藍遷移到分離膠底部0.5cm處，關閉電源。
④ 從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用去離子水沖洗干凈。準備進行免疫印操作。
4．免疫印跡操作-轉膜
① 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉移緩沖液的容器中，浸泡15-20min.
② 帶上手套，裁剪好濾紙（Whatman,3MM CHR）和NC膜，濾紙和膜大小為83mm×75mm，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉移緩沖液中，驅除留于膜上的氣泡。
③ 打開轉移盒并放置淺盤中，用轉移緩沖液將海綿墊*浸透后將其放在轉移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的Whatman,3MM濾紙。
④ 小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡（用轉移緩沖液潤濕并戴手套以轉移緩沖液潤濕膠面，小心將NC膜放在膠面上，從凝膠的一邊開始輕輕放下可避免氣泡，注意一定要戴手套或鑷子接觸膜）。
⑤用去離子水清洗緩沖液槽，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉移緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上，關上轉移盒并插入轉移槽。
⑥將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預冷的轉移緩沖液。
⑦將整個裝置放在磁力攪拌器上并開始攪拌，連接好轉移電極恒壓100V轉移90min，若轉移過夜則恒壓30V。
⑧電轉完畢后，將NC膜置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時或4℃過夜。
5．免疫檢測
一抗與靶蛋白的結合
① 封閉的膜用PBST漂洗2-3次。
② 將加樣槽洗滌干凈，用蒸餾水潤洗，晾干，將膜用一次性手套覆蓋好，按標記和實驗設計切下膜條（一般為3 mm寬左右）按順序置于加樣槽中，作好實驗記錄，加入相應的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
③ 室溫下于搖床孵育2h或4℃過夜。
④ 棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復4次。
酶標記二抗與一抗的結合
① 根據實驗需要和設計選擇合適的酶標二抗和稀釋濃度（用含0.5%脫脂奶粉的PBS稀釋），每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h或4℃過夜，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復4次。
顯色反應（注：二抗一般有兩種常用標記酶，HRP和AP，其相對應的顯色底物試劑盒為DAB和BCIP/NBT）
① HRP標記二抗顯色
用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）顯色，按順序依次加Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光，混勻，將膜加入顯色液中避光顯色15 min左右終止反應，記錄實驗結果，將NC膜晾干掃描保存
② AKP標記二抗顯色
用AKP緩沖液洗膜5min，棄去AP緩沖液，加入顯色液（66µlNBT溶液同10mlAKP緩沖液充分混合均勻后加入33µl BCIP溶液1h內使用），室溫下顯色（37℃可加速反應），顯色反應通常在30min內可完成。用20mM EDTA/TBS洗膜終止反應,記錄實驗結果，將NC膜晾干掃描保存。反應溶液可預先配置，可在4℃儲存一年以上。
三、說明
1． WB對照系統
陽性對照：有標準品，或陽性血清、陽性上清。
陰性對照：測血時用相應小鼠未免疫血清，測培養上清，用無克隆培養上清。
空白對照：不加一抗，用1%BSA代替。
無關對照（替代對照）：用無關項目一抗，或無關項目的抗體。
2.切割膜時，大小一般為3-5mm,一抗的體積為每條膜保證1ml。
3.KSHV、MCMV、HCMV項目測血時，血清稀釋度為1:500-1:1000。
4. KSHV、MCMV、HCMV項目WB鑒定時，一抗如為IgG型,二抗采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562; 一抗如為IgM型，二抗采用AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422。
5.多肽項目WB鑒定，二抗全部采用AP-Anti mouse IgG(Whole molecule),SIGMA,CAT#A-3562。