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一種提高單克隆抗體產量的簡易方法
閱讀：430 發布時間：2018-9-13近年來單克隆抗體已廣泛應用于基礎理論與臨床應用研究［1］。如何制備質量好產量高的單克隆抗體是當前各有關實驗室研究的重要問題，通常用于生產單克隆抗體的方法有兩種：①利用純系小鼠生產免疫腹水，該法的優點是產量和效價高，但純化困難，價格昂貴，生產周期長；②雜交瘤細胞常規體外培養法，此法雖然產量不價低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，較易純化且成本低，但此法若需大量生產則需特殊設備［2］。近有人報道用雜交瘤細胞培養也可提高單克隆抗體的產量且方法簡便［3］。經我們對3株抗人衰變加速因子（Decay-Accelerating Factor，DAF，CD55）單克隆抗體的制備和產量測定，獲得較為滿意的結果，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 純化抗原及抗體 純化的可溶性重組DAF由英國Reading大學Goodfellow博士惠贈。抗人DAF單克隆抗體IC6培養上清（1μg／ml）由日本Fukushima醫學院Fujita博士惠贈。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（工作濃度1∶1000），購自中山生物制品有限公司。
1.2 培養基 RPMI 1640（Gibco產品），含2mmol L-谷氨酰胺，100U／ml青霉素，100μg／ml鏈霉素和10％FCS。
1.3 雜交瘤細胞系 DA11、DG3、DG9雜交瘤細胞均由本實驗室建立，經SP2／0與免疫小鼠脾細胞融合篩選而成，抗體亞類均為IgG1，能穩定分泌抗人DAF單克隆抗體［4］。
1.4 平臥式常規法培養 將DA11、DG3、DG9雜交瘤細胞用常規細胞培養法培養在25ml的方瓶中加培養液5ml，置37°C孵箱3～4d后，當瓶中只剩下少于5％有活力的細胞時離心收集上清，－20°C保存備用。
1.5 直立式培養 將DA11、DG3、DG9雜交瘤細胞常規培養在平臥式細胞培養瓶中直到細胞密度達90％～95％時，補充培養液至瓶頸（總量為30ml），加橡皮塞直立式放置在37°C孵箱中，每天觀察細胞并晃動1次，可見死細胞不斷脫落至瓶底，活細胞繼續增殖，直到培養液變酸后離心收集上清，－20°C保存備用。
1.6 標準曲線的制作 以不同濃度的IC6上清進行間接ELISA（具體步驟見1.7），每一濃度重復3孔，測得OD值，進行回歸分析，繪制標準曲線。
1.7 單克隆抗體含量測定 采用間接ELISA法，具體步驟如下：（1）包被純化人DAF于96孔ELISA板，50μl／孔，4°C，18～24h。（2）用0.02M PBS＋0.05％Tween20（PBS-T）將板孔洗3次，3min／次，空干，加入不同濃度的鼠抗人DAF單克隆抗體上清，50μl／孔，37°C孵育50min。（3）同上洗滌，加入1∶1000羊抗鼠IgG酶標抗體，50μl／孔，37°C，50min。（4）同上洗滌，加入鄰苯二胺-H2O2溶液37°C顯色20min后，在BIO-RAD Model 3550自動酶聯檢測儀上選擇490nm測OD值。平臥式與直立式培養收獲的上清及IC6上清同時進行試驗，以SP2／0骨髓瘤細胞上清作為陰性對照。根據標準曲線計算每種樣品中的單抗含量。
2 結果與討論
經統計學處理抗人DAF單克隆抗體IC6上清濃度在0．001～0．1μg／ml之間時，其含量與OD值呈線性關系（見圖1）。分別將平臥式和直立式收獲的
圖 1 IC6上清標準曲線
Fig 1Standard curves of supernatant of IC6
細胞培養上清用間接ELISA法測定其效價及含量，結果3株雜交瘤細胞產生的抗人DAF單克隆抗體，其直立式培養上清的OD值均略高于平臥式培養的上清，將3株單克隆抗體的OD值從標準曲線上查得其含量，結果見表1。直立式比平臥式產量提高8～14倍，與Susan等的結果相符。直立式的特點是培養液用量多，且在生長過程中死亡細胞不斷脫落至瓶底，
表1 平臥式與直立式培養單抗產量比較
Tab 1 Production of mAbs in horizontal and standing flask methods
Cell line Horizontal culture Standing culture
Ig concentration
（μg／ml）
Total yiele
（μg／falsk）
Ig concentration
（μg／ml）
Total yiele
（μg／falsk）
DG3 22．97 114．85 35．89 1076．7
DG9 26．31 131．55 37．14 1114．2
DA11 26．91 134．55 65．45 1963．5
使培養瓶留出更多的空間供活細胞生長而繼續分泌抗體；平臥式培養，則死亡細胞占據空間影響活細胞的分裂增殖，需傳代后方能繼續增殖，增加污染機會及工作量。
由于本法無需特殊設備、簡便易行、節省人力物力，減少污染機會，一般實驗室可推廣應用。作者：女，37歲，本科，實驗師
參考文獻
1 陸德源.現代免疫學.上海：上海科技出版社，1995.35
2 Jaspert R，Geske T，Teichmann A，et al．Laboratory scale production of monoclonal antibodies in a tumbling chamber．J Immunol Methods，1995，178：77
3 Susan Ker hwe Ou，Paul HP，Terson T．A more efficient and economical approach for monclonal antibody production．J Immunol Methods，1997，209：105
4 鄒 強，謝佩蓉，鄭 萍.抗人DAF單克隆抗體的制備及鑒定.免疫學雜志，1999，15（2）：122