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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS），大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，即每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS－復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無(wú)關(guān)，在一定條件下，蛋白質(zhì)的分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率間呈負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測(cè)定，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。

二、儀器與試劑

1、材料：

硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。

2、試劑：

（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）

（2）10%的SDS溶液

（3）10%的過(guò)硫酸銨溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris，PH8.8

（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris，PH6.8

（7）電極緩沖液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3

（8）樣品緩沖液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭

（9）染色液：0.15%考馬斯亮藍(lán)R250，溶于脫色液

（10）脫色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液

（11）標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。

3、儀器設(shè)備：

電泳儀、垂直電泳槽等。

三、操作步驟

1、凝膠制備：

用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配制好的分離膠溶液倒入，滴加入無(wú)離子水，待凝膠聚集后，倒出無(wú)離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。

2、上樣：

分別取樣品若干ml于離心管中，按1/1～1/5比例加入5×樣品緩沖液，再沸水浴中加熱3～5min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過(guò) 30μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和試驗(yàn)樣品注入樣品槽。點(diǎn)樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA（2～3mA/em），保持電流穩(wěn)定不變，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到離分離膠底1～2cm時(shí)，即可停止電泳。

3、染色：

電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37℃溫箱中保溫過(guò)夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

四、結(jié)果 （略）

五、注意事項(xiàng)

1、SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），如果比例不當(dāng)，就不能得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。

3、有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。

4、有的蛋白質(zhì)（如：電荷異常或結(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測(cè)相對(duì)分子量。

5、如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。