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細(xì)胞裂解液的制備
閱讀：529 發(fā)布時(shí)間：2018-8-7一、試劑準(zhǔn)備
1、新鮮配制冷的 RIPA 裂解緩沖液:
150 mM NaCL
1% NP-40 (去垢劑)
0.1% SDS (去垢劑)
2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)
1 mM PMSF (蛋白酶抑制劑)
1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制劑)
1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制劑)(任選)
以上所有試劑均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。
2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF
1.5 mM EDTA
1mM NaVanadate （釩酸鈉）(任選)
3、對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)佳的細(xì)胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生長(zhǎng)面積）。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的 PBS在培養(yǎng)瓶中充分洗滌細(xì)胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS ，重復(fù)以上操作2-3遍。在后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。
2、 向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA 裂解緩沖液 (每75cm2 培養(yǎng)瓶加1ml). 然后用細(xì)胞刮子沿著瓶壁開始刮細(xì)胞，如果所需要刮的同種細(xì)胞有多瓶，則將瓶刮下的細(xì)胞液吸出轉(zhuǎn)入下一瓶中繼續(xù)刮 (由于處理后的細(xì)胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點(diǎn)的吸液管吸取)。
3、 吸出刮好的細(xì)胞裂解液置于14ml 離心管中 （置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下的細(xì)胞。
4、 盡可能將多的細(xì)胞裂解液收集到14ml的離心管中，樣品插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細(xì)胞碎片或沉淀，應(yīng)離心10000rpm,10分鐘，留取上清。
5、 取出小量細(xì)胞裂解液測(cè)其蛋白濃度（用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計(jì)，在A280測(cè)定），分裝保存在 -70℃。