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大鼠主動脈內皮細胞培養實驗
閱讀：466 發布時間：2018-7-23大鼠血管內皮細胞培養可以：（1）用于血液流動性、防止血栓形成、調節血管張力等研究；（2）用于選擇性通透性以及免疫調節等方面研究。
實驗方法原理
貼塊法適用于內皮細胞產量低的、管徑較小血管的內皮細胞培養，其方法較酶消化法簡便、經濟。但缺點使易混有成纖維細胞和平滑肌細胞，前者的貼壁時間和內皮接近，后者貼壁較內皮慢，而且會被肝素所抑制。
實驗材料 雄性Wistar大鼠
試劑、試劑盒 DMEM胎牛血清內皮細胞生長因子肝素鈉青鏈霉素明膠胰蛋白酶PBSD-Hanks’液
儀器、耗材 手術器械眼科剪眼科鑷培養皿手術刀培養瓶CO2培養箱
實驗步驟
一、實驗方法
1. 頸椎脫臼處死大鼠，將整個大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1 min。在無菌狀態下，逐層剪開胸腔，分離取出主動脈，放含無菌 D-Hanks’液培養皿中。
2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后，用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內的凝血數次，再放入另一無菌培養皿中。
3. 用眼科剪縱向剪開血管，平展在培養皿中。用非常銳利的手術刀將其切成1 mm3 大小的動脈植 塊(或者用剪刀剪，依照個人習慣)，然后種植到培養瓶或培養皿(培養瓶或皿用1%明膠預置 37℃下過夜， 使用前2 h 移入CO2培養箱中。用時可以先經含 10%小牛血清的培養液沖洗)。將動脈植塊的內膜面與瓶底接觸，種植密度約為 1 塊/cm2 。
4. 置培養箱中靜置2 h(干貼壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養液，液量以略蓋過動脈植塊內膜面，而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后，更換培養液，加入 2-3 ml 培養液。
5. 72 h 左右的時候，當觀察到內皮細胞充分長出，而成纖維細胞剛要長出的時候，將動脈植塊除去，刮除成纖維細胞，換培養液1 次。以后每2 天換液一次，每次換1/2~1/3 的液量。繼續培養 8-10 d， 細胞融合成單層，即可傳代。
二、實驗結果
植塊培養法進行的原代培養，一般在培養2-3 天，動脈植塊周圍即有細胞生長，并漸向外延伸，呈扁平短梭形或多角形；約8-10 d 后細胞融合成片。采用vWF 免疫組化鑒定，主要表達在細胞漿中。
一、實驗討論
植塊培養法適用于內皮細胞產量低的、管徑較小血管的內皮細胞培養，其方法較酶消化法簡便、經濟。但缺點使易混有成纖維細胞和平滑肌細胞，前者的貼壁時間和內皮接近，后者貼壁較內皮慢，而且會被肝素所抑制。
而由于成纖維細胞生長較快，隨著傳代次數越多，其污染的程度越重，從而使培養失敗。因而，抑制和減少成纖維細胞是大鼠主動脈內皮細胞培養的關鍵問題。本法采用的方法是：
1. 在合適的時間去除動脈塊，即當內皮細胞已經爬出，初具規模時(大概在72 h 左右的時候，按照本文的培養液條件，因為有生長因子，內皮容易爬出和增殖)，去除動脈塊，并刮除成纖維細胞。
2. 使用含肝素的培養液(在培養液中加入100 U/ml 的肝素)，可使內皮細胞純度提高；
3. 高濃度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促進內皮細胞增殖，而使內皮細胞成為優勢細胞。另外，動脈植塊干貼壁的時間不宜超過2 h，而加培養液這一步驟尤為關鍵，過少會使內膜接觸不到培養液，過多則易使動脈小塊漂浮，導致貼壁失敗。因此，干貼壁后加培養液，加入少量高營養的培養液(0.5-1 ml)，可以避免這些問題。
組織塊貼塊的時候，不可避免會有一些塊貼的方向不是內膜面，那么后將爬不出內皮，甚至長出較多雜質細胞，需刮除。
另外，部分塊即使大小合適，方向也正確，也可能爬不出來，去除組織塊的時候，應該以大局為重，看到內皮細胞已經爬出較多，而雜質細胞也開始爬出的時候，就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個大概的時間，初學者不可以拘泥。