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應用細胞融合技術制備染色體提前凝集標本
閱讀：396 發布時間：2018-7-19實驗原理
在自然條件下或用人工的方法(物理、化學或生物)將兩個或兩個以上的同種或不同種細胞融合成一個細胞的過程稱為細胞融合。
七十年代初，由于發現M 期細胞內有某種促進染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細胞融合和染色體技術的基礎上，建立了制備染色體提前凝集標本的方法。即讓M 期細胞與間期(I 期)細胞融合，從而誘導I 期細胞染色質提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome， PCC)。這項技術已應用于細胞周期分析、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結構的研究、多種因素作用細胞使染色體損傷及修復效應的研究，預測某種血液病的病程、愈后及復發的臨床實踐等方面。
實驗試劑
1. 50％PEG
2. Hanks 液(pH7.4)
3. RPMI－1640 培養基(含10％滅活小牛血清，pH7.4)
4. 10ug/ml秋水仙素
5. 0.075mol/L KCl 低滲液
6. 0.2％次甲基蘭染液
7. 1/15mol/L PBS
8. Carnoy 固定液
9. Giemsa 染液
實驗設備
1. 光學顯微鏡
2. 離心機
3. 水浴箱
4. 熱吹風機
5. 10ml 刻度離心管
6. 5 號針頭注射器
7. 試管架
8. 試管夾
9. 染色槽
10. 廢液缸
11. 冰凍載玻片
12. 吸水紙
13. 擦鏡紙
14. 香柏油瓶
15. 記號筆
16. 酒精燈
實驗材料
人宮頸癌上皮細胞(Hela 細胞)
實驗步驟
1. 收集培養的M 期Hela 細胞
1) 取一瓶處于對數生長期的Hela 細胞，向培養基中加入10ug/ml 的秋水仙素使終濃度為0.04ug/ml。
2) 在37℃二氧化碳培養箱中繼續培養12h，使大量生長的細胞被阻斷于M 期。
3) 每組取一瓶經上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復振搖，使培養液不斷沖刷細胞層(或用吸管吹打)，M 期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。
4) 將含有M 期細胞的培養基移入離心管中，1000rpm 離心5min。
5) 棄去上清，加入5ml Hanks 液，用吸管吹打成細胞懸液。
2. 收集培養的Hela 細胞
1) 取一瓶生長良好的Hela 細胞，棄去培養基。
2) 加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2-3min，棄去胰酶消化液。
3) 加入5ml Hanks 液，用吸管吹打成單個懸浮細胞備用。
3. 50％ PEG 的制備
1) 稱取0.5g PEG(MW 4,000)，倒入離心管中。
2) 在酒精燈上加熱使之融化(約為0.5ml)。
3) 再加入預熱的Hanks 液0.5ml，混勻，置37℃水浴中待用。
4. 細胞融合
1) 將上述兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。1000rpm 離心5min，棄上清，再小心地吸盡殘液。
2) 用指彈法彈散細胞，在37℃水浴條件下吸取0.5ml 50％ PEG，逐滴加入離心管中，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90 秒鐘。然后，迅速加入5ml Hanks 液以終止PEG 的作用。在37℃水浴中靜置5min。
3) 1000rpm 離心5min，棄上清，加入2ml 含有血清的RPML-1640 培養基，同時用5 號針頭的注射器垂直加入10ug/ml 的秋水仙素1 滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30～60min。
5. 制備PCC 標本
1) 細胞溫育后，以1000rpm 離心5min，棄上清，加入10ml 0.075mol/L KCL 低滲液輕輕制成懸液。
2) 在37℃處理25min 左右，終止時加入1ml Carnoy 固定液進行固定。
3) 1000rpm 離心8min，棄上清，指彈離心管底部使細胞分散，加入10ml Carnoy 固定液固定30min。
4) 1000rpm 離心5min，棄去上清，留0.2ml 殘液，用吸管輕輕吹打成懸液。
5) 取預冷的載玻片，制一張滴片，烤干。
6) Giemsa 染色15min 左右，水洗，干燥后鏡檢。