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技術(shù)文章

ELISA實(shí)驗(yàn)操作中的成敗細(xì)節(jié)

閱讀：344 發(fā)布時(shí)間：2018-7-16

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酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）因其具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中的各種抗原和抗體的測(cè)定。盡管ELISA操作簡(jiǎn)單，但是小實(shí)驗(yàn)里也蘊(yùn)含著大文章，ELISA操作各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大，稍不注意就會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果?，F(xiàn)在小魚就跟大家818應(yīng)用ELISA應(yīng)該了解的一些常識(shí)。

ELISA分類及具體過(guò)程

一般，ELISA可分為以下四大類：直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA。其他的ELISA都隸屬于這四類ELISA或由這四類ELISA組合衍生。

ELISA的具體操作的視頻鏈接：

下面分析ELISA實(shí)驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果的原因，并給出相應(yīng)的解決方法。

樣品收集和保存

用于ELISA測(cè)定常用的臨床標(biāo)本是血清（漿）。要注意避免嚴(yán)重溶血，因?yàn)檠t蛋白中含有具有類似過(guò)氧化物活性的血紅素基團(tuán)，在孵育時(shí)很容易吸附于固相，與HRP底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性。

樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染，一方面細(xì)菌分泌的酶可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶會(huì)對(duì)相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。另外，樣品混勻時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷?，反?fù)顛倒混勻即可。

一般而言，如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)，可將樣品及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆?；而?duì)隔天再檢測(cè)的樣本，應(yīng)及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆茫粢L(zhǎng)期保存樣品，將其置于-70℃凍存。

實(shí)驗(yàn)具體步驟

試劑準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)開始前，需將試劑盒從冰箱中拿出來(lái)在室溫放置20min，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡，也可使溫育時(shí)反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快的達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。

其次，目前商品中ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)其所提供的濃縮液進(jìn)行稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)該保證質(zhì)量。此外，底物反應(yīng)液應(yīng)該反應(yīng)顯色前進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用。同時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的均一性，實(shí)驗(yàn)中所有試劑在加樣前必須搖勻。

加樣

因ELISA的靈敏度較高，則應(yīng)該按規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)。

加樣品時(shí)，單孔用量要求：≥20ul/指標(biāo)，如需要做2個(gè)復(fù)孔則血量≥60ul/指標(biāo)。如果用量充足，提供50ul/孔/指標(biāo)。具體用量也需根據(jù)試劑盒的要求而定。

吸取樣品時(shí)，加樣槍頭不應(yīng)粘附多余的液體；加樣時(shí)不可90度向孔中滴加液體，否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

加樣時(shí)速度不可過(guò)快，否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性；要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。

孵育

一般，孵育時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，所需時(shí)間相對(duì)較短。常用的孵育溫度為37℃，孵育1-2h。

孵育時(shí)應(yīng)貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗。孵育時(shí)，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，避免因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致緊附于反應(yīng)孔周圍的非特異性結(jié)合。

孵育時(shí)，要盡量排除“邊緣效應(yīng)”，即96孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因，是因?yàn)?6孔板周孔與中心孔的表面或熱力學(xué)特征不同。因此，可采用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至孵育溫度（37℃）。

洗板

為了確保ELISA測(cè)定的特異性，洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì)，減少背景信號(hào)，增加分析的信噪比。

手工洗板時(shí)，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離。使用半自動(dòng)洗板時(shí)，應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出。為了達(dá)到較好的洗滌效果，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，即在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次。

以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05% Tween20的中性PBS，其中，吐溫20的濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實(shí)驗(yàn)的靈敏度。

顯色

目前以HRP作為標(biāo)記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以O(shè)PD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。顯色劑配制后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（肉眼可見淺藍(lán)色的TMB時(shí)）要棄之不用。

在加入底物開始顯色反應(yīng)前，是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。

顯色反應(yīng)條件一般為37℃或室溫反應(yīng)15-30分鐘。加終止液時(shí)，要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽(yáng)性。

讀板

讀板時(shí)要保證酶標(biāo)板清潔，同時(shí)也要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。

通常，單波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是指以對(duì)顯色具有大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是敏感波長(zhǎng)如450nm的吸光值與非敏感波長(zhǎng)下如630nm的吸光值之差，可排除板內(nèi)臟物的影響。

同時(shí)，由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，是使用雙波長(zhǎng)比色。

數(shù)據(jù)結(jié)果分析

ELISA的測(cè)定結(jié)果可分為兩種：定性測(cè)定和定量測(cè)定。前者只需確定陰性或陽(yáng)性即可；后者則需要給具體的數(shù)值。在定量測(cè)定中，經(jīng)常要將標(biāo)準(zhǔn)品所獲得的吸光值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

下面則簡(jiǎn)單介紹用excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法

1）輸入相應(yīng)數(shù)據(jù)