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間接ELISA中試劑的配制及反應流程
閱讀：468 發布時間：2018-7-13實驗試劑
1. 包被緩沖液：(0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
蒸餾水 1000ml
4℃保存，一周內用完。
2. 磷酸鹽緩沖液(PBS，PH 7.4)
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.2g
KCl 0.2g
Na2HPO4.12H2O 3.65g
蒸餾水 1000ml
3. 洗滌液(0.01 mol/L，pH7.4的PBST)
1L PBS中加入0.5ml Tween-20
4. 封閉液(5% 脫脂奶粉)
5g 脫脂奶粉加入100ml PBS緩沖液中。
5. 一抗及二抗稀釋液(2% 脫脂奶粉)
2g 脫脂奶粉加入100ml PBS緩沖液中。
6. 配制顯色液所需試劑：
1) 0.1M 檸檬酸(1.05g檸檬酸 50ml雙蒸水)
2) 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.1628g Na2HPO4.12H2O 100 ml雙蒸水)
3) 1% TMB (10mgTMB 200μl無水乙醇 800μl水)
這三種溶液均須現用現配。
7. 顯色液：
分別取A液 24.3ml，B液25.7ml，混合后加入50ml 雙蒸水。然后從中取出9.9ml移入新試管中，再加入100μl C液，后加入10μl 30% H2O2。
注意：30% H2O2溶液應避光保存。C液和H2O2溶液在臨用前加入。
8. 終止液(2M的H2SO4)
11 ml濃硫酸 89ml水
實驗步驟
1. 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至適濃度(如2μg/ml)，每孔加入100μl稀釋好的抗原，于4℃下過夜。
2. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘。洗滌時將板子放在96孔板振蕩器上，600轉/分鐘。
3. 封閉：每孔加入300μl封閉液，放于濕盒中，37℃，孵育2h。注意要將濕盒提前放入37℃溫箱中預熱。
4. 洗滌：同步驟2。
5. 加一抗，即被檢血清：每孔加入用一抗稀釋液稀釋好的被檢血清100μl，放于濕盒中，37℃，孵育1h。注意設置陽性和陰性對照。
6. 洗滌：洗滌方式同步驟2，次數為4次。
7. 加酶標二抗：按商品化酶標二抗的推薦濃度或者預實驗中較好的濃度稀釋二抗，每孔加100μl，放于濕盒中，37℃，孵育1h。
8. 洗滌：同步驟6。
9. 加顯色液：每孔加100μl顯色液，避光反應15分鐘。
10. 終止：每孔加入50μl終止液。
11. 讀數：將ELISA反應板放入酶標儀中，讀取OD值。注意酶標儀應提前15分鐘打開預熱，還有讀數前用酒精棉球擦拭反應板底部，以除去指痕等污漬。