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抗體標記與檢測指南
閱讀：340 發(fā)布時間：2018-7-11科技文獻中有很多抗體標記方法指南，我們往往難以選擇方法。本指南可以幫助您更好的理解標準化學標記方法及它們的優(yōu)缺點，同時還介紹了 Lightning-Link一步法抗體標記技術。該技術極大簡化了抗體標記步驟，利用該技術標記抗體不需要您具備太多化學方面的知識，并且手頭操作時間僅需短短的30秒！
抗體與標記物
在多種免疫實驗（流式細胞術, ELISA, western blotting, 免疫組化等）中，抗體被廣泛應用于檢測和定量抗原。直接識別抗原的抗體被稱為一抗（primary antibody），賦予檢測的特異性。大多數(shù)免疫檢測中還需加入標記物，賦予實驗可檢測性。標記物包括有機染料、熒光蛋白、有色微粒和酶。
直接檢測法 Vs.間接檢測法
包含標記物的免疫檢測一般有直接法和間接法兩種形式。直接檢測法中，標記物通過共價鍵直接連接到一抗上。而對于間接檢測法，標記物則是共價連接到與一抗特異性結(jié)合的二抗上。間接法檢測包括兩步：步，用未標記的一抗進行孵育，抗體與抗原結(jié)合（若存在抗原），洗去未結(jié)合的抗體（一般3~5次），第二步則是加入標記二抗孵育（通常1小時），洗滌去掉未結(jié)合的二抗，然后量化結(jié)合在一抗上的標記物。
在直接法中，標記物直接與一抗共價結(jié)合，因此僅需與含有抗原的樣本孵育這一步驟，而且只需一次洗滌，而間接法則需要兩輪孵育與洗滌步驟。直接法簡化了試驗的流程，降低了試驗的變異性，增加了數(shù)據(jù)的可靠性。然而一抗的共價修飾可以導致抗體親和力的改變，這種情況的出現(xiàn)與標記二抗帶來的非特異性結(jié)合的問題相比而言，顯得無關緊要。下表列舉出了直接法與間接法的主要優(yōu)缺點比較。
表.直接法與間接法的比較
方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
直接法 | 操作簡單，結(jié)果可靠； 僅需使用一抗，檢測快速； 無二抗的非特異性結(jié)合。 | 由于標記可能導致一抗的免疫反應性降低； 信號放大作用較弱。 |
間接法 | 一抗含有多個標記二抗可結(jié)合的表位，因而靈敏度升高，信號放大作用較強。 | 二抗可能發(fā)生非特異性結(jié)合； 孵育及洗滌步驟增多。 |
既然直接標記法具有很多優(yōu)點，但為何眾多的免疫分析仍采用間接法呢?原因是市場上帶有標記的一抗較少，而且直接標記一抗較困難，這在過去也許是您的困擾，但是當您讀到本篇指南的后時就會對抗體標記充滿信心。
抗體標記方法
您僅需理解基本的化學原理，哪些基團發(fā)生反應，根據(jù)化學結(jié)合物的種類去選擇合適的試劑，而不需要糾結(jié)化學結(jié)構和完整的化學名稱。抗體和所有蛋白一樣，是由氨基酸殘基組成的。蛋白的氨基基團（N-末端及賴氨酸殘基的側(cè)鏈）通常被用于共價鏈接標記物。盡管在文獻中報道了多種多樣的標記方法和成百上千的化學修飾試劑，然而實際上只有少數(shù)重要的方法和試劑。無論何種方法，幾乎毫無例外的都是將標記物共價連接到抗體分子的賴氨酸殘基上。
以下是幾種主要的抗體標記方法：
1.琥珀酰酯 (NHS)法
當使用熒光染料標記時，通常可購買內(nèi)配有NHS琥珀酰酯（也稱為琥珀酰亞胺酯）的活化標記物。在適當條件下，活化的染料可與抗體分子反應（抗體分子通常含有多了賴氨酸基團）而形成結(jié)合物。根據(jù)標記抗體和游離染料的大小不同，過量的活性染料可通過層析法去掉，純化的步驟會導致一部分標記抗體的損失，但是為了避免實驗的高背景，這些純化步驟是必要的。
2.碳二亞胺（Carbodiimides）法
這類試劑（常見的如EDC）在氨基和含羧基的分子間形成共價連接。碳二亞胺活化羧基，活化的中間體隨后被氨基（抗體分子的賴氨酸殘基）吸附。碳二亞胺通常用于連接抗體和羧化的顆粒（如乳膠顆粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板。碳二亞胺很少用于將蛋白標記物偶聯(lián)到抗體上，因為這兩種分子都含有氨基（賴氨酸）和羧基。大多數(shù)碳二亞胺試劑都不溶于水，因此它們主要用于有機合成化學，比如生產(chǎn)NHS活性染料。真正用于蛋白/抗體標記的碳二亞胺試劑為EDC（也稱為EDAC），常以鹽酸鹽的形式出售。
3.過碘酸鈉（Sodium periodate）法
過碘酸鈉是一種用于活化辣根過氧化物酶的強氧化劑。這種過碘酸鹽與糖鏈反應產(chǎn)生能與抗體的賴氨酸殘基反應的醛基。由于HRP分子本身含有很少的賴氨酸，因而相對容易獲得抗體-HRP結(jié)合物，且無明顯的HRP多聚化發(fā)生。該方法的缺點是賴氨酸和醛基結(jié)合物的形成是可逆的，只有在硼氫化鈉還原劑的作用下才能穩(wěn)定，然而硼氫化鈉有一定的危險性。
4. 異硫氰酸鹽（Isothiocyanate）法
該方法值得特別一提是因為FITC（異硫氰酸熒光素）的重要意義。FITC作為抗體和蛋白的標記物已使用了很多年。異硫氰酸鹽較NHS琥珀酰亞胺酯穩(wěn)定，因此在保存中不易分解，但是與抗體的反應性較差。FITC不溶于水，須溶于有機溶劑。該方法的局限性在于反應需在PH9.5或更高的條件下進行，否則標記反應會非常緩慢，然而一些單克隆抗體在高PH條件下可能會被破環(huán)。
5.異（基）雙功能試劑 (Heterobifunctional reagents)
當標記物為蛋白分子（如堿性磷酸酶AP、藻紅蛋白PE）時，由于抗體和標記分子都含有大量賴氨酸殘基，因此標記流程略為復雜，可能發(fā)生預期外的其他反應。在這種情況下，通常需要對其中一個分子（如抗體）的一些賴氨酸進行修飾，以此創(chuàng)造一個新的反應基團（X），而標記物上的賴氨酸作為另一個反應基團（Y）。當抗體與標記物混合時，利用雙功能試劑引入Y基團，隨之與X基團發(fā)生反應，從而形成異二聚體結(jié)合物（即標記抗體）。該方法的主要缺點是標記前需要一些分離步驟將X標簽結(jié)合到抗體上，這些分離步驟對標記反應是不利的。
緩沖液及添加物--抗體標記的關鍵因素
抗體溶液中除抗體蛋白分子外，可能還含有少量其他物質(zhì)如緩沖液、鹽、或其他蛋白及添加物。添加物對不同標記方法的影響程度不同，但絕大多數(shù)的標記抗法都是利用抗體分子上的賴氨酸殘基，因此在標記反應中應避免加入含有伯胺的緩沖液或添加物。有時，標記反應前需要重新純化抗體，尤其當抗體中含有穩(wěn)定蛋白（BSA）或低分子量物質(zhì)（氮化鈉、Tris、甘氨酸）時。甘氨酸和Tris緩沖液常用來純化和中和抗體，后加入氮化物來防止微生物的滋生。純化實驗中常用低PH值的檸檬酸洗脫抗原親和柱上的抗體，然而檸檬酸會對碳化二亞胺參與的反應產(chǎn)生嚴重的干擾。因此，純化過的抗體在標記前需要進行透析。需要特別注意的是，透析時如能更換2-3次緩沖液，那么去除小分子雜質(zhì)的效率更高。這并不意味著您需要準備3倍或更大量的緩沖液一次性來透析，恰恰相反，多次透析延長了透析的時間，從而達到更好的雜質(zhì)去除效果。如用1L的緩沖液透析3次的效果遠比用5L的緩沖液透析一次的效果好。如果透析后需要加入氮化合物，盡可能使用低的濃度（如0.02%）或者將抗體以濃縮形式保存。例如，在5mg/ml 抗體中加入0.02%氮化物，若后續(xù)標記實驗使用1mg/ml 抗體時，氮化物的濃度則降低為0.004%；然而如果將0.1% 氮化物加入0.5 mg/ml抗體溶液中，毫無疑問會對標記反應產(chǎn)生嚴重的干擾。
抗體濃度及純度
大多數(shù)標記反應對抗體都有一個純度要求（如>90%，>95%）和濃度要求（至少0.5mg/ml）。市售的許多商業(yè)化抗體一般都是適用于標記的純化形式，但并非所有情況都如此，有些抗體常以雜交瘤組織培養(yǎng)上清（TCS）、腹水或血清等形式出售。TCS通常含有多種其他蛋白和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸），這對于標記是個非常大的問題。如果您使用的是TCS，那么純化（如過蛋白A柱）步驟則是必需的。腹水和血清原液中的抗體濃度較TCS中的抗體濃度高，但它們同樣也是不純的，含有高濃度的干擾物質(zhì)，進一步的純化往往也是必要的。
上述介紹了常用的傳統(tǒng)標記方法以及每種方法的優(yōu)勢和劣勢。下面要介紹一種新式的標記方法（Lightning-Link®），該方法相比傳統(tǒng)方法有很多優(yōu)勢