Hypoxyprobe? Gemini套件組件的詳細描述

1) Hypoxyprobe?-1（皮莫尼達唑鹽酸鹽）和Hypoxyprobe?-F6（CCI-103F）是替代的2-硝基咪唑。皮莫尼達唑鹽酸鹽的分子量為290.8，水溶性高，為400毫摩爾相當于116毫克/毫升。CCI-103F是一種六氟化的2-硝基咪唑，具有六個磁等價的氟原子；分子量為337.2；水溶性為5.3毫摩爾相當于1.8毫克/毫升。CCI-103F通常以10%二甲基亞砜/花生油混合物的形式腹腔給藥（Ljungkvist等人，《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》62(4): 1157-1168, 2005）。皮莫尼達唑鹽酸鹽和CCI103F在柔和光線下儲存時都非常穩定。

皮莫尼達唑和CCI-103F在缺氧細胞中被還原激活。激活的中間體與蛋白質、肽和氨基酸中的硫醇（巰基）基團形成穩定的共價加合物。主要的抗皮莫尼達唑和抗CCI-103F抗血清以不交叉反應的方式結合到這些加合物，從而允許通過免疫化學手段進行檢測。

2) 不交叉反應的兔抗血清，能夠結合還原激活的皮莫尼達唑（PAb2627）和CCI-103F（PAbF6）的蛋白質加合物，作為稀釋的抗血清供應，含有0.09%的疊D化鈉和1%的牛血清白蛋白作為穩定劑。感興趣的組織可以通過免疫組化在福爾馬林固定的石蠟包埋切片或冷凍固定切片上進行研究，或者在組織解離后通過流式細胞術進行研究，或者通過西方印跡。抗血清結合到缺氧細胞中皮莫尼達唑或CCI-103F的蛋白質、肽和氨基酸加合物，但免疫組化分析的組織處理會洗去肽和氨基酸加合物，因此免疫組化檢測僅依賴于缺氧組織中皮莫尼達唑或CCI-103F的蛋白質加合物。

在連續的福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片上進行免疫過氧化物酶分析涉及將組織切片與大約1:500稀釋度的抗皮莫尼達唑或抗CCI103F抗血清100微升孵化。然后應用顯色劑山羊抗兔二抗以顯示缺氧標記物加合物的分布。下面提供了一個詳細的免疫過氧化物酶協議作為一般指南，但強調Hypoxyprobe?技術是穩健的，鼓勵研究者自行修改。請參閱Ljungkvist等人，《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》62(4): 1157-1168, 2005及其中參考文獻，以了解有關冷凍切片的研究。

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Hypoxyprobe Gemini試劑盒：

應用：使用Hypoxyprobe Gemini試劑盒通過免疫化學檢測手段，包括免疫過氧化物酶、免疫熒光或流式細胞術，追蹤單個組織樣本中缺氧的縱向變化。Kleiter等人在連續切片上使用免疫過氧化物酶分析（Kleiter等人，《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》64(2): 592-602, 2006），而Ljungkvist等人（《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》62(4): 1157-1168, 2005）在同一組織切片上使用雙重缺氧標記的免疫熒光分析。

數量：a. Hypoxyprobe? Gemini試劑盒分別包含100、200或1000毫克的缺氧標記物，即Hypoxyprobe?-1（皮莫尼達唑鹽酸鹽）和Hypoxyprobe?-6（CCI103F）。通常，在小動物研究中每個標記物的劑量為每公斤體重60毫克。

b. 每個試劑盒包含稀釋的親和純化的抗皮莫尼達唑和稀釋的抗CCI103F不交叉反應的兔抗血清（分別為PAb2627和PAbF6），含有0.09%的疊d化鈉和1%的牛血清白蛋白作為穩定劑。100毫克和200毫克試劑盒各包含一個200微升單位的抗血清；1000毫克試劑盒包含兩個200微升單位的每種抗血清。抗血清的最佳工作稀釋度應由研究者確定，但1/500 -1/1000稀釋度與過氧化物酶結合的山羊抗兔二抗結合時可給出強烈的免疫過氧化物酶染色。對于雙重標記免疫熒光研究，可能更適合使用1/50-1/200的較低稀釋度（Ljungkvist等人，《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》62(4): 1157-1168, 2005）。

不提供：抗兔二抗試劑或其他免疫組化試劑（緩沖液、抗原檢索劑等）。

儲存：a. 將Hypoxyprobe?-1和Hypoxyprobe?-F6存放在室溫下避光處（也可以存放在2-8攝氏度）。

b. 將兔抗血清（PAb2627 & PAbF6）存放在2-8攝氏度。

切勿冷凍。

檢測說明：

在嚙齒動物中進行雙重標記研究，首先通過靜脈輸注或腹腔注射皮莫尼達唑鹽酸鹽的水溶液，劑量為每公斤體重60毫克（大約每只小鼠1.5毫克）。皮莫尼達唑鹽酸鹽在鹽水中的溶解度為116毫克/毫升，因此可以使用非常小的體積。15至90分鐘后，進行改變缺氧程度的干預。然后，以10%二甲基亞砜/90%花生油溶解的CCI-103F（請參閱Ljungkvist等人，《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》62(4): 1157-1168, 2005）以每公斤體重60毫克的劑量腹腔注射。60至120分鐘后，收集感興趣的組織。CCI-103F的劑量為每公斤體重60毫克，從摩爾基礎上看比皮莫尼達唑鹽酸鹽少，但這被CCI-103F更長的血漿半衰期所補償（CCI-103F的t1/2 = 90分鐘，而小鼠中皮莫尼達唑為25分鐘）。

注射后，Hypoxyprobe?標記物分布到所有組織，但只與含硫的蛋白質、肽和氨基酸形成加合物，這些細胞的氧氣濃度低于14微摩爾——相當于37攝氏度下的部分壓力pO2 = 10毫米汞柱。正常組織如肝臟、腎臟和皮膚擁有pO2為10毫米汞柱或更低的細胞，這些組織將結合Hypoxyprobe?標記物。在收獲時組織中殘留的Hypoxyprobe?標記物將在組織解離時被激活和結合。然而，與組織在典型實驗期間暴露的量相比，殘留的Hypoxyprobe?標記物濃度非常小，因此在組織收獲時由于殘留的Hypoxyprobe?標記物引起的任何非特異性結合都是不可檢測的。

圖表。Gemini套件用于比較在腫瘤攜帶犬的單次腫瘤活檢中相鄰組織切片口服給予的皮莫尼達唑（Pimo，左側面板）和靜脈給予的CCI103F（F6，右側面板）。Gemini套件中對皮莫尼達唑和CCI-103F加合物不交叉反應的兔抗血清允許獨立評估兩個標記物的結合（Kleiter等人，《國際放射腫瘤學、生物學、物理學雜志》64(2): 592-602, 2006）。

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探針公司）專注于研發非侵略性的缺氧標志物（Hypoxia maker）和缺氧依賴性的細胞因子，所有產品皆基于Pimonidazole核心結構來開發。 使用Pimonidazole HCl作為缺氧標記物，廣泛用在狗、大小鼠。缺氧探針試劑盒核心組分為：缺氧探針（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探針的抗體。不同試劑盒中的探針和抗體標記不同（可應用于免疫熒光（IF），免疫組化（IHC），WB或流式細胞分析（FC））

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