天狼星紅和快綠是一種用于區(qū)分膠原蛋白與其周圍物質(zhì)的染料組合。天狼星紅專門綁定[Gly-X-Y]原纖維膠原的螺旋結構，無論膠原類型或種類如何，而Fast Green與非膠原結合蛋白質(zhì)。通過利用這兩種染料的d特特征，hondrex，股份有限公司提供了一種簡單的半定量測定試劑盒來測定培養(yǎng)細胞層和組織切片中膠原蛋白和非膠原蛋白的量（1-2）。因為該測定不需要膠原蛋白增溶，可用于測量各種組織中的總膠原蛋白含量（3-7）。

由于天狼星紅和快綠分別在540 nm和605 nm處有吸收，因此提取的染料的OD值可用于計算樣品的膠原蛋白和非膠原蛋白含量。用于組織切片為10-20的一般組織學研究μm厚，膠原蛋白和非膠原蛋白的檢測靈敏度分別大于3μg/切片和50μg/切片。這個試劑盒中的試劑足以對30-50個樣本進行染色。

作為Chondrex在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦Chondrex銷售產(chǎn)品膠原蛋白染色試劑盒。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

膠原蛋白染色試劑盒：

格式：玻璃載玻片和組織培養(yǎng)板。

檢測類型：染料染色。

檢測時間：根據(jù)樣本類型不同而有所變化。

標準范圍：膠原蛋白：每切片3 μg

非膠原蛋白質(zhì)：每切片50 μg

樣本數(shù)量：每個試劑盒可處理30-50個樣本。

樣本類型：培養(yǎng)細胞和組織切片。

推薦樣本稀釋：不適用。

著色劑：不適用（在540和605 nm讀取）。

存儲：室溫可保存12個月。

檢測協(xié)議

以下樣本制備方法為標準協(xié)議，因此根據(jù)樣本類型，可能需要進行優(yōu)化。

A. 石蠟包埋組織切片

1. 準備石蠟包埋的組織切片（約30-50 mm?，厚度為10-20 μm）。

2. 通過以下步驟去除石蠟：

1） 二甲苯，10分鐘

2）二甲苯與100%乙醇的1:1混合液，10分鐘

3）100%乙醇，10分鐘

4）50%乙醇/蒸餾水，5分鐘

5）蒸餾水，5分鐘

3. 將單獨的載玻片轉移到培養(yǎng)皿中。

4. 在每個樣本上加載0.2-0.3毫升染料溶液，確保w全浸沒組織切片，并在室溫下孵育30分鐘。  

**注意：** 為避免染料溶液蒸發(fā)，在載玻片下放一塊濕濾紙，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)皿。

5. 小心吸去染料溶液。

6. 用0.5毫升蒸餾水反復沖洗染色的組織切片，直到水清澈為止。  

**選項：** 這些樣本可以在顯微鏡下觀察，而不需進行后續(xù)的提取步驟。用100%乙醇脫水，然后用二甲苯清洗，并在樹脂介質(zhì)中封固。

7. 在每個樣本上加載1毫升染料提取緩沖液，并輕輕吸取，直到顏色從組織切片中洗脫出來。

8. 收集洗脫的染料溶液，并在540 nm和605 nm用分光光度計讀取OD值。

B. 冷凍組織切片

1. 根據(jù)標準方法準備冷凍組織切片（約30-50 mm?，厚度為10-20 μm）。

2. 用1X PBS清洗。

**可選固定步驟（8,9）：** 添加0.5毫升Kahle固定液，w全浸沒每個組織切片，在室溫下孵育10分鐘。

**Kahle固定液配方：**

60毫升蒸餾水

28毫升95-100%乙醇

10毫升37%甲醛

2毫升冰醋酸

3. 去除固定液，用1X PBS清洗，并將單獨的載玻片轉移到培養(yǎng)皿中。

4. 在每個樣本上加載0.2-0.3毫升染料溶液，確保w全浸沒組織切片，并在室溫下孵育30分鐘。  

**注意：** 為避免染料溶液蒸發(fā)，在載玻片下放一塊濕濾紙，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)皿。

5. 小心吸去染料溶液。

6. 用0.5毫升蒸餾水反復沖洗染色的組織切片，直到水清澈為止。  

**選項：** 這些樣本可以在顯微鏡下觀察，而不需進行后續(xù)的提取步驟。用100%乙醇脫水，然后用二甲苯清洗，并在樹脂介質(zhì)中封固。

7. 在每個樣本上加載1毫升染料提取緩沖液，并輕輕吸取，直到顏色從組織切片中洗脫出來。

8. 收集洗脫的染料溶液，并在540 nm和605 nm用分光光度計讀取OD值。

C. 體外培養(yǎng)細胞層

1. 如果計劃在進行染料提取步驟之前安裝細胞層并用顯微鏡觀察，請在24孔培養(yǎng)板的每個孔底部放置一個消毒的圓形玻璃載玻片。否則，跳過此步驟。

2. 在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞，直至所需時間。

3. 去除培養(yǎng)基，并用1X PBS清洗孔。

4. 添加0.5毫升Kahle固定液，w全浸沒細胞層，在室溫下孵育10分鐘。  

**Kahle固定液配方：**

60毫升蒸餾水

28毫升95-100%乙醇

10毫升37%甲醛

2毫升冰醋酸

5. 去除固定液，并用1X PBS清洗。

6. 添加0.2-0.3毫升染料溶液，確保w全浸沒固定細胞層，并在室溫下孵育30分鐘。  

如果細胞在玻璃載玻片上，請去除載玻片并將其放入培養(yǎng)皿中進行染色。  

**注意：** 為避免染料溶液蒸發(fā)，在載玻片下放一塊濕濾紙，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)皿。

7. 小心吸去染料溶液。

8. 用0.5毫升蒸餾水反復沖洗染色的細胞層，直到水清澈為止。  

**選項：** 這些樣本可以在顯微鏡下觀察，而不需進行后續(xù)的提取步驟。用100%乙醇脫水，然后用二甲苯清洗，并在樹脂介質(zhì)中封固。

9. 在每個樣本上加載1毫升染料提取緩沖液，并輕輕吸取，直到顏色從樣本中洗脫出來。

10. 收集洗脫的染料溶液，并在540 nm和605 nm用分光光度計讀取OD值。

Chondrex成立于1996年，致力于開發(fā)和生產(chǎn)高純度膠原蛋白、抗膠原蛋白單克隆抗體和多種ELISA試劑盒等產(chǎn)品，為研究人員提供研究類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis ,RA)發(fā)病機制和篩選潛在治療方法所需的工具。Chondrex生產(chǎn)400多種免疫學研究產(chǎn)品，涵蓋腎炎、結腸炎和過敏性哮喘等一系列自身免疫性疾病模型。此外，還開發(fā)了炎癥相關產(chǎn)品，如細菌毒素抗體ELISA、細胞因子檢測ELISA等。

作為Chondrex在中國區(qū)域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的Chondrex產(chǎn)品。

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