Cayman的堿性磷酸酶（ALP）比色活性測(cè)定試劑盒提供了一種方便的方法，用于在血清、血漿、組織樣本和細(xì)胞裂解液中測(cè)量ALP活性，檢測(cè)限為0.5 U/L。ALP活性的測(cè)量是通過監(jiān)測(cè)色原性底物對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP）的脫磷酸作用來完成的。在第一步中，ALP使pNPP脫磷酸生成對(duì)硝基苯酚。在第二步中，酚羥基在堿性條件下被脫質(zhì)子，生成對(duì)硝基苯酚鹽，產(chǎn)生強(qiáng)烈的黃色，可以使用405納米處的吸光度來測(cè)量。在ALP活性成為速率限制步驟的情況下，405納米處吸光度的增加與樣本中的ALP活性直接成比例。

需要但未提供的：請(qǐng)下載試劑盒手冊(cè)，以驗(yàn)證是否需要超純水（Milli-Q或等效物）或該測(cè)定的其他任何組分。

警告：本品不適用于人類或獸醫(yī)用途。

測(cè)定方案：

艾美捷Cayman的堿性磷酸酶比色活性檢測(cè)試劑盒（#701710-480），用于在血清、血漿、組織樣本和細(xì)胞裂解液中測(cè)量ALP活性，檢測(cè)限為0.5 U/L。ALP活性的測(cè)量是通過監(jiān)測(cè)色原性底物對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP）的脫磷酸作用來完成的。在第一步中，ALP使pNPP脫磷酸生成對(duì)硝基苯酚。在第二步中，酚羥基在堿性條件下被脫質(zhì)子，生成對(duì)硝基苯酚鹽，產(chǎn)生強(qiáng)烈的黃色，可以使用405納米處的吸光度來測(cè)量。在ALP活性成為速率限制步驟的情況下，405納米處吸光度的增加與樣本中的ALP活性直接成比例。

預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

試劑準(zhǔn)備

1. ALP測(cè)定緩沖液

此瓶含有30毫升的ALP測(cè)定緩沖液（項(xiàng)目編號(hào)400083），可直接使用。

2. ALP底物

此瓶含有作為ALP底物的pNPP片劑（項(xiàng)目編號(hào)400112）。將兩片片劑溶解在2.7毫升ALP測(cè)定緩沖液中。這是足夠測(cè)定一個(gè)96孔板的底物體積。注意：為了防止污染片劑，避免用手直接接觸片劑。保護(hù)ALP底物溶液免受光線照射。它在室溫下穩(wěn)定四小時(shí)。

3. ALP陽性對(duì)照

此瓶含有10微升的牛ALP作為陽性對(duì)照。將4微升的ALP陽性對(duì)照（項(xiàng)目編號(hào)400113）與396微升的ALP測(cè)定緩沖液混合，得到ALP陽性對(duì)照（100X）庫存溶液。進(jìn)一步將ALP陽性對(duì)照（100X）庫存溶液稀釋，將4微升的ALP陽性對(duì)照（100X）與396微升的ALP測(cè)定緩沖液混合，得到ALP陽性對(duì)照（1X）工作溶液。ALP陽性對(duì)照（1X）工作溶液在室溫下穩(wěn)定四小時(shí)。兩種稀釋的ALP陽性對(duì)照酶庫存在4℃下至少穩(wěn)定72小時(shí)。

4. ALP停止溶液

此瓶含有2M氫氧化鈉（NaOH）溶液。將2.5毫升的ALP停止溶液（項(xiàng)目編號(hào)400114）與7.5毫升的純水混合，最終濃度為500mM。稀釋的ALP停止溶液在室溫下至少穩(wěn)定一個(gè)月。

添加和恢復(fù)

測(cè)定緩沖液、小鼠肝組織提取物和人血清被添加了ALP，并使用ALP比色活性測(cè)定試劑盒進(jìn)行分析。通過與在緩沖液中測(cè)量的相同添加物的活性比較，計(jì)算了血漿和組織提取物中ALP的百分比恢復(fù)。結(jié)果如下。誤差條代表ALP活性多次測(cè)量之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖. 小鼠肝組織提取物和人血清中的添加和恢復(fù)。

堿性磷酸酶比色活性檢測(cè)試劑盒文獻(xiàn)參考：

1.Sharma,U.,Pal,D,and Prasad,R.Alkalinephosphatase:Anoverview.Ind.JClin.Biochem.29(3),269-279(2014).

2.Vimalraj,S.Alkaline phosphatase:Structure,expression andits function inbone mineralization.Gene 754,144855(2020).

3.Berg,J.M,Tymoczko,J.L,Stryer,L.Glycolysis is an energy-conversionpathway in many organisms.Biochemistry (2002).

4.Berg,J.M.,Tymoczko,J.L,Stryer,L.Oxidative phosphorylation.Biochemistry (2002).

5.Epstein,E,Kiechle,EL,Artiss,J.D,et al.The clinical use of alkalinephosphatase enzymes.Clin.Lab.Med.6(3),491-505(1986).

6.Kamimura,K,Abe,H,Kawai,H,et al.Advances inunderstanding andtreating liver diseases during pregnancy:A review.World J.Gastroenterol.21(17),5183-5190(2015).

7.Magnusson,P,Davie,MWJ.,and Sharp,CA.Circulating and tissue-derivedisoforms of bone alkaline phosphatase in Paget's disease of bone.Scad.JClin.Lab.Invest.70(2),128-135(2010).

8.Narayanan,S.Serum alkaline phosphatase isoenzymes as markers of liverdisease.Ann.Clin.Lab.Sci.21(1),12-18(1991).