HyStem-HP含有硫醇化透明質酸、肝素和明膠，可輕松制作 3D 水凝膠。 HyStem-HP 2.0 版提供與 HyStem-HP 1.0 版相同的細胞環境。 HyStem V2.0 套件組件現在將使用緩沖的 1X PBS 進行重構。所得組分還將產生 pH 值中性的等滲鹽水凝膠。版本 1.0 至版本 2.0 的最終 pH、滲透壓和流變特性相同。 HyStem-HP 水凝膠是w全化學定義的，非常適合細胞應用，其中生長因子的緩慢、持續釋放對于重建所需的微環境至關重要。 HyStem-HP 水凝膠試劑盒包含硫醇修飾的透明質酸和硫醇修飾的肝素 (Heprasil)、硫醇修飾的變性膠原蛋白 (Gelin-S) 和硫醇反應性交聯劑 PEGDA (Extralink) 的組合。 HyStem-HP 水凝膠中的固定肝素模擬了細胞外基質中通常存在的硫酸肝素蛋白聚糖。

研究表明，細胞間通訊在骨再生過程中扮演著重要角色，而細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作為細胞間通訊的重要媒介，近年來受到了廣泛關注。

EV輸送系統改善了骨骼修復：手術后0至8周活體小鼠的微型CT掃描。EV組是右側缺陷，凝膠組是左側缺陷。

實驗方法：

1. 細胞培養和EVs的提取

從健康捐贈者的骨髓中分離并培養BMSCs。

收集BMSCs培養上清液，通過梯度超速離心法提取EVs。

通過透射電鏡和流式細胞術驗證EVs的形態和表面標記物。

2. 成骨細胞分化實驗

體外實驗：將提取的EVs加入成骨細胞培養基中，通過Alizarin Red染色觀察鈣沉積情況，以及通過qPCR和Western Blot檢測成骨相關基因（如RUNX2、ALP、OCN、OPN）的表達水平。

細胞周期和增殖分析：通過流式細胞術（FACS）和MTT實驗分析EVs對成骨細胞增殖的影響。

3. microRNA測序和功能驗證

microRNA測序：通過RNA測序技術比較BMSCs和EVs中microRNA的表達譜，發現miR-196a、miR-27a和miR-206在EVs中高度富集。

功能驗證：將miR-196a、miR-27a和miR-206的模擬物（mimics）和抑制劑分別轉染成骨細胞，觀察其對成骨分化的影響。

4. 動物實驗

模型建立：在SD大鼠顱骨上制造直徑為5mm的臨界尺寸骨缺損，實驗組填充含EVs的水凝膠，對照組僅填充水凝膠。

評估方法：通過micro-CT掃描、組織學和免疫組化染色評估新骨形成情況。

實驗結果：

1. EVs的提取和鑒定

電鏡觀察：EVs呈典型的杯狀結構，直徑在30-100 nm之間。

流式細胞術：EVs表達典型的EVs標記物CD63。

2. EVs對成骨細胞分化的影響

體外實驗：EVs處理組成骨細胞鈣沉積顯著增加，成骨相關基因表達上調。

細胞增殖分析：EVs對成骨細胞增殖的影響較小，主要促進成骨分化。

3. microRNA在EVs中的作用

測序結果：miR-196a、miR-27a和miR-206在EVs中高度富集。

功能驗證：miR-196a在促進成骨分化方面作用最為顯著，其抑制劑可部分逆轉EVs的成骨分化效應。

4. 動物實驗結果

micro-CT掃描：實驗組新骨形成顯著多于對照組。

組織學染色：HE和Masson染色顯示實驗組骨缺損區域新骨形成良好，骨小梁結構完整。

在本研究的體內實驗中，HyStem-HP水凝膠（#GS314F #GS315F#GS1006F，巰基修飾透明質酸，明膠和肝素水凝膠試劑盒）作為EVs的載體被成功應用于顱骨缺損模型中。HyStem-HP水凝膠具有良好的生物相容性和可降解性，能夠為EVs提供一個穩定的釋放環境，延長其在缺損部位的滯留時間，從而提高EVs的生物利用度和治療效果。此外，HyStem-HP水凝膠還能夠促進細胞的黏附和增殖，進一步增強骨再生的效果。因此，HyStem-HP水凝膠在本研究中作為EVs的載體，對于實現EVs在體內的有效釋放和骨再生的促進具有重要作用和價值。