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DNA是攜帶生物體遺傳信息的重要分子,它的完整性對細胞存活至關重要。然而,在生命活動中,DNA時刻遭受著內源性(氧化自由基、復制叉崩塌等)或外源性(電離輻射、烷化劑等)刺激,DNA損傷不可避免。
檢測DNA損傷的方法有很多,根據其原理大致可以分為3類: 基于損傷DNA理化性質的改變檢測DNA損傷、基于分子雜交檢測DNA損傷以及基于DNA損傷后形成的產物檢測DNA損傷。前兩種方法是基于熒光標記直接觀測DNA的損傷情況,而基于DNA損傷后形成的產物檢測DNA損傷是通過標記物的檢測間接反映DNA的損傷程度。
※ 基于DNA損傷后形成產物進行檢測
DNA損傷過程中可形成某些特定的損傷產物,可通過檢測損傷產物(磷酸化H2AX、8-OHdG等)來評估DNA損傷。也可標記損傷DNA,如末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL),通過標記物的檢測間接反映DNA的損傷程度。
1.雙鏈斷裂標志物磷酸化H2AX檢測法 H2AX是組蛋白H2A家族成員之一,包含一個進化保守區域SQ位于真核細胞的C末端,分子量為14KD,139位有個絲氨酸殘基,在細胞發生DNA雙鏈斷裂后的數分鐘內,將會被ATM,ATR和PRKDC磷酸化,形成γH2AX,進而迅速招募DNA修復蛋白和凋亡蛋白到損傷部位,每個雙鏈的斷裂區會有成百上千的γ-H2AX,然后在1h左右數量和密度達到峰值。由于γH2AX的出現與DNA雙鏈斷裂緊密關聯,是目前國內外研究細胞DNA雙鏈斷裂應激反應的熱點之一,同時也可以作為DNA雙鏈斷裂的標志物。
由于與DNA雙鏈斷裂緊密相關,γH2AX可以作為雙鏈修復的標志物 1.原位DNA損傷分析試劑盒(96次分析),P-6001-096 2.H2AFX 多克隆抗體,PAB8764 3.8-OHdG DNA損傷定量直接分析試劑盒(比色法)(48次分析),P-6003-48
DNA斷片標記法 原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)是一種檢測凋亡細胞DNA鏈斷裂片段的方法。細胞凋亡發生時,內源性核酸內切酶將DNA降解成片段,在脫氧核苷酸末端轉移酶的作用下,底物dUTP 或BrDU(無或有熒光標記)可連接到DNA斷片的3-OH末端,采用熒光顯微鏡或流式細胞儀對標記物進行分析,實現在單細胞水平檢測凋亡細胞的DNA碎片。
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