隨著NGS檢測的臨床有效性不斷地被驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室檢測的樣本量逐漸地增多，實(shí)現(xiàn)NGS復(fù)雜流程在工作站上自動化是大勢所趨。但是，在開放式的工作站上，客戶如何實(shí)現(xiàn)樣本打斷自動化，一直沒有很好的解決方案。
通常，NGS建庫使用的打斷方法不外乎下面兩種，各有優(yōu)勢又各有缺點(diǎn)。
一種是基于超聲波的物理打斷方法或稱為機(jī)械打斷。這種方法需要專門的設(shè)備和耗材，以Covaris的設(shè)備為代表。物理打斷有其 優(yōu)勢，比如說樣本斷點(diǎn)的隨機(jī)性高，不會有位點(diǎn)的偏好，也不會受樣本純度的影響。然而物理打斷的設(shè)備和耗材成本很高，并且難以在工作站中整合超聲設(shè)備實(shí)現(xiàn)自動化。通常情況下物理打斷法處理一個樣本需要平均3-5分鐘的時間，因此一旦樣本數(shù)量變多，它就變成一個操作單一同時又極度耗時的方法。
另一種是基于酶切打斷的方法，包括轉(zhuǎn)座子或各種混合水解酶等對DNA進(jìn)行化學(xué)切斷。酶切的方法不需要特殊的設(shè)備，只需要普通的PCR儀，可以批量的處理樣本并輕松在工作站上實(shí)現(xiàn)自動化。同時酶切較物理打斷的DNA損耗更小，文庫轉(zhuǎn)化效率更高，對于一些珍貴的樣本，文庫構(gòu)建的 更好。但是，目前的酶切試劑盒存在或多或少的數(shù)據(jù)偏好性。除此之外，酶切建庫試劑盒構(gòu)建的文庫會有一定比例的假陽性嵌合，特別是做一些基因融合檢測的應(yīng)用時會干擾檢測結(jié)果的判讀。
雖然這些假陽性干擾可以通過數(shù)據(jù)分析進(jìn)行過濾，但這對生信人員提出了更高的要求且?guī)砹烁嗟墓ぷ髁俊Ｍ瑫r，酶切對于樣本會有比較高的要求，比如樣本的純度(特別是EDTA的含量）和樣本的降解程度，都會對酶切的效果產(chǎn)生諸多的影響。這使得實(shí)驗(yàn)室對于不同來源或不同類型的樣本需要設(shè)置不同的SOP。對實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和管理人員都造成了一定的困擾。
如何整合物理打斷和酶切打斷的優(yōu)勢，解決這些實(shí)現(xiàn)自動化的障礙？
答案是：
羅氏診斷KAPA EvoPlus Kit上市了！?
KAPA EvoPlus 主要解決了以下4個問題：
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圖1 100ng gDNA,37℃ 25 min 打斷，
KAPA UDI接頭，8循環(huán)擴(kuò)增
（圖片來源：羅氏診斷整理）
對含有不同EDTA濃度緩沖液的DNA進(jìn)行相同條件的打斷和建庫，可以看到文庫的大小都符合預(yù)期。
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圖2 與物理打斷的建庫試劑盒（KAPA HyperPrep）進(jìn)行比較，
可以看到EvoPlus已經(jīng)將假陽性的比例降至同一水平。
（圖片來源：羅氏診斷整理）
圖3 經(jīng)內(nèi)部測試，與國內(nèi)外市場上同類型酶切建庫試劑盒
進(jìn)行平行比較，Evoplus的假陽性比例 低。
（圖片來源：羅氏診斷整理）
3
KAPA EvoPlus簡化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了移液步驟以降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)混液及96孔板式包裝更匹配自動化工作站，另有管式包裝可供手動建庫用戶選擇。
圖4 打斷、末端修復(fù)和加A尾整合成一步反應(yīng)，預(yù)混液包裝
無需進(jìn)行反應(yīng)體系配制，簡化實(shí)驗(yàn)操作流程。
（圖片來源：羅氏診斷整理）
4
KAPA EvoPlus即便是ReadyMix預(yù)混液包裝，依然能長期穩(wěn)定保存，試劑盒效期18個月。
圖5 經(jīng)內(nèi)部測試，打斷試劑在室溫5周之后
依然可以保持相當(dāng)?shù)拇驍嘈Ч?/span>
（圖片來源：羅氏診斷整理）
*僅用于科學(xué)研究，不用于臨床診斷。MC-CN-01945有效期至2025年1月26日
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