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植原體菌種保藏方法說明

閱讀:609          發布時間:2017-6-20
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植原體是一類無細胞壁的原核微生物,能侵染包括農作物、林木、花卉、雜草等植物,給農、林業帶來巨大損失,近年來,此類病害在某些重要植物處于蔓延和加重的趨勢。這類微生物尚不能在人工培養基上離體培養,其細胞結構、與寄主植物的互作等方面也有其明顯不同特點,研究制定此類微生物的保藏技術規程,對于植原體菌種資源的規范和安全保藏、科學研究及合理利用具有重要意義

1、本規程適用于各類植原體菌種的保藏。

2、術語與定義

2.1植原體phytoplasma

指寄生于植物韌皮部和介體昆蟲體內的、具有三層單位膜結構的無細胞壁的原核生物。一般引起植物葉片黃化和發育畸形等癥狀。

2.2植物組織培養planttissueculture

在無菌的條件下,將離體的植物器官和組織在人工控制的環境下培養,使其再生形成完整植株的過程。培養植原體—植物共生體即是培養已感染植原體病菌的植物外植體。

3、原理

植原體菌種尚不能在離體人工培養基上培養。被感染的寄主植物攜帶植原體,因而通過對植物莖段的繁殖,即可達到對所攜帶植原體的繁殖和培養。植物組織培養和營養繁殖,使植原體所受的選擇壓力較低,較低的溫度條件可大大減緩植物和所感染植原體的代謝活動,從而減少菌株突變,降低繁殖速度,有效保持菌種原有性狀。

4技術要求

4.1保藏方法

用組織培養法保藏感染植原體的植物組織,于5-25C溫度范圍內保藏。

4.2植物組織培養基

選用適于植物組織正常生長的培養基,不含四環素簇抗生素或其它對植原體生長和繁殖有抑制作用的成分。

4.3培養溫度和光照

培養溫度20-28℃為宜

光照強度在1000-3000lx,光期為10-14h/d

4.4保藏溫度和時間

常溫保藏(20-28℃),保藏時間1-3個月

低溫保藏(6-10℃),保藏時間6個月至1年。

注:保藏溫度低于4℃會凍傷植物組織材料而導致植原體死亡。

4.5保藏期檢測

定期檢查保藏菌種的房間、冷庫、冰箱的溫度、濕度。

檢查各保藏試管有無雜菌污染現象,如發現雜菌污染,則取出該管重新移植,培養后補缺。

4.6移植復核

大量植原體-植物共生體進行移植時,各菌株的編號、所用培養基需仔細核對無誤。每次移植培養后,對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄,核實無誤再行存放。

4.7保藏指標

當獲得的組培苗表現典型癥狀或在熒光顯微鏡下觀察到特異植原體DNA熒光后即可進行菌株的保藏。

5操作方法與步驟

5.1帶菌外植體采集

在田間采集表現典型癥狀的新鮮枝條,剪去葉和嫩稍,經酒精消毒劑表面消毒后,截成具節莖段,移入培養基上培養。

5.2無雜菌組培苗的獲得

外植體長出新枝后,選無雜菌感染的外植體,截取新枝,移入新配制的培養基上培養和繁殖。如培養基被雜菌污染,將組培苗再進行表面消毒處理,移入新的培養基上培養,重復操作2-3次,直至獲得無雜菌組培苗為止。

5.3組織帶菌鑒定

用DAPI熒光顯微鏡技術和PCR技術鑒定組織帶菌狀況和濃度。

DAPI熒光顯微鏡技術步驟:取植物幼莖、葉柄或根等,進行組織切片,厚度在100mm左右,用5%戊二醛固定2小時左右,用0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌后,用1mg/ml4'6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,zui后置于落射熒光顯微鏡下檢查韌皮部特異性植原體DNA熒光,激發濾光片波長為365nm,阻斷濾光片波長為420nm。

PCR技術步驟:從組織中提取植物和植原體總DNA,用植原體16SrRNA等基因序列的引物進行PCR基因擴增,然后進行瓊脂糖電泳,檢測特異性擴增產物譜帶。

5.4常溫保藏

植原體-植物共生體在適宜的組織培養基上培養,并正常溫度和光照下(20-28C,光照強度在1000-3000lx)進行保藏,保藏周期為1-3個月。

5.5低溫保藏

將正常溫度和光照下(20-28C,光照強度在1000-3000lx)培養的植原體-植物共生體移入含組織培養基的試管內,移入6-10C低溫冷藏柜內保藏,1-2個月將試管暴露于正常培養溫度和光照條件下補光2-3天,然后存放于低溫冷藏柜繼續保藏,保藏周期為6個月至1年以上。

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