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標題：Absolute Quantification of Dystrophin Protein in Human Muscle Biopsies using Parallel Reaction Monitoring (PRM)

期刊：JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY

發表時間：2019年

摘要

杜氏肌肉營養不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一種發病率相對較高的單基因疾病，由X染色體上編碼抗肌萎suo蛋白基因(Dystrophin)突變，導致無法產生足夠的抗肌萎suo蛋白，患者的肌肉組織逐漸被脂肪和纖維化組織取代，大約每5000名新生男嬰中就有1人患病。針對此疾病需要一種可靠和準確的方法來量化人類骨骼肌活檢中的肌營養不良蛋白，這對于評估肌營養不良素替代療法在Duchenne肌營養不良中的療效以及深入了解肌營養不良水平與Becker肌營養不良疾病嚴重程度之間的關系至關重要。目前測量肌營養不良蛋白的方法，如蛋白質印跡和免疫熒光，雖然簡單明了，但缺乏準確性，有時甚至缺乏特異性。本文通過采用標準化一種靶向質譜法，使用全長13C6-Arg、13C6、15N2-Lys標記的肌營養不良蛋白和平行反應監測(PRM)來測定肌肉中肌營養不良素的絕對量。該方法被發現是可重復的，定量極限低至每毫克總肌肉蛋白30pg的肌營養不良蛋白。然后對該方法進行測試，以測量來自健康捐贈者和Duchenne和Becker肌營養不良患者的肌肉活檢中肌營養不良蛋白的水平。

引言

肌營養不良蛋白是維持肌纖維完整性和功能的肌營養不良相關蛋白復合物(DAPC)的重要成員。肌營養不良通過DAPC將肌纖維的細胞內肌動蛋白絲連接到細胞外基質，并在肌纖維收縮和松弛過程中穩定肌膜。缺乏肌營養不良蛋白質，如杜氏肌肉營養不良(DMD)或其異常的定性和定量表達如Becker氏肌營養不良癥(BMD)，導致肌膜不穩定和肌纖維退化。DMD患者通常在20多歲時死亡，而BMD患者存活時間更長，但疾病嚴重程度和發病率不同。肌營養不良蛋白的數量和質量顯著影響肌肉穩定性。在過去幾年中，已經開發出了恢復DMD患者中缺失的肌營養不良蛋白的有希望的療法，目前正處于II期和III期臨床試驗中。然而，使用這些療法恢復的肌營養不良蛋白的量還沒有很好的定義，這導致了關于肌營養不良蛋白的多少足以穩定肌膜和改善患者預后的相互矛盾的結論。此外，肌營養不良蛋白水平與BMD疾病嚴重程度之間的關系尚不清楚。量化骨骼肌組織中肌營養不良蛋白的準確方法對于作為既可以作為評估肌營養不良蛋白替代療法療效的藥效學生物標志物，也可以作為評估疾病嚴重程度的替代生物標志物。

研究結果

01.測定SILAC標記肌管中肌營養不良蛋白的絕對量

使用含有不同百分比肌營養不良蛋白的SILAC肌管提取物刺入骨骼肌提取物的肌營養不良蛋白質的滴定曲線來測試該方法的線性。通過在含有可變比例的正常肌提取物與DMD肌提取物的骨骼肌提取物中加入SILAC肌管提取物來生成滴定曲線，生成兩條滴定曲線以確定肌營養不良蛋白的線性和定量限度。

02.WB檢測肌營養不良蛋白滴定曲線

WB檢測結果顯示肌營養不良蛋白427kDa， α-肌動蛋白(100kDa)用作上樣對照，并檢查其線性關系。

研究結論

在這項研究中，作者標準化了一種穩健可靠的靶向質譜法，以量化人體骨骼肌裂解物中肌營養不良蛋白的絕對量。研究發現該方法在寬動態范圍內是線性的，并且與通過蛋白質印跡的相對定量相比更具可重復性。該方法還可用于量化和表征肌營養不良蛋白基因不同突變的BMD患者肌肉中的肌營養不良蛋白質，它可以精確地將這些突變映射到蛋白質中的必需和非必需結構域。該方法也可用于確定未來接受不同肌營養不良蛋白替代療法的DMD患者中肌營養不良素的水平或恢復的肌營養不良因子。