一、免疫熒光的原理
免疫熒光(Immunofluorescence，IF)技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。
二、IF分類
中文全稱 | 縮寫 | 中文全程 | 實驗樣本 |
細胞免疫熒光 | IF-IC | 細胞免疫熒光 | 懸浮或貼壁細胞 |
組織免疫熒光 | IF-F | 冰凍切片免疫熒光 | 冰凍組織，抗原保存更加，但要避免出現冰晶 |
IF-P | 石蠟切片免疫熒光 | 石蠟包埋的細胞團或組織，易儲存，形態佳 |
三、IF實驗流程
1）樣品準備：對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌 (1000rpm、5min) 2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片；
2）固定：4%多聚甲醛(PFA)溶液固定細胞15min，PBS洗滌3遍，每次5min；
3）通透：0.5% TritonX100，通透15-20min，PBS洗滌3遍，每次5min；
4）封閉：3%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉30min-1h ，封閉的作用是可以減少一抗和二抗與非靶標位點進行非特異性結合時所產生的本底信號；
5）抗孵育：封閉過后，不用洗，直接將多余的BSA吸走，用稀釋后的一抗（用3% BSA稀釋）4度過夜孵育;
6）二抗孵育：PBST洗滌3遍，每次5min，洗去未結合的抗體。而后用稀釋后的二抗（用3% BSA稀釋）室溫避光孵育1h，PBST洗滌3遍，每次5min；
7）細胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗滌3遍，每次5min（染細胞核是為了定位細胞）；
8）拍照：立即用激光共聚焦或熒光顯微鏡進行拍照，如果需要等待，則避光放在4°保存。
四、檢測方法
檢測方法分為直接檢驗和間接檢驗，我們一般多采用間接檢驗（一抗+二抗）的方式。
抗原檢測 | 熒光素偶聯一抗 | 熒光素偶聯二抗 | 二抗處聯HRP，酪氨信號放大系統 |
優點 | 操作簡便，一步法，多染信號強度中等時不受抗體來源限制 | 信號強度中等 | 信號強，多染時不受抗體來源限制 |
缺點 | 信號強度低 | 兩步法，背景可能變高 | 需要摸索條件，可能帶來背景或非特異染色 |
五、免疫熒光雙染
在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染色雙重免應焚光標記法也分為直接法和間接法。
1）直接法：將兩種不同熒光素偶聯的抗體（如抗A和抗B）以適當比例混合，樣本孵育，潤洗，封片，鏡檢；
特點：簡便可靠，不需要考慮一抗種屬來源的問題，但靈敏度較低。
2）間接法：用未標記的兩種一抗薄育樣本，潤洗后，加入兩種不同的熒光素偶聯的對應二抗辯育樣本，潤洗，封片，鏡檢；
3）特點：使用此法應注意兩種特異性一抗必須來源于不同種屬，且熒光標記二抗、一抗的種屬要相匹配。
六、IF注意事項
1）固定時間影響熒光固定效果，針對細胞樣品，如果用4%多聚甲醛固定，推薦固定時長15min，時間太短沒有達到固定效果時間太長會導致甲醛被氧化成甲酸，沒有固定作用了；
2）保持醛固定液新鮮，否則自發熒光背景會升高；
3）使用抗體時，需要查詢說明書。因為不同抗體使用場景不一樣，確認抗體是否能用于細胞IF、冰凍切片IF、 石蠟切片IF；
4）細胞密度是整個實驗能否成功的關鍵點之一。如果細胞數量太多，產生疊加，也會影響整體熒光效果；
5）洗滌過程輕柔，防止加液過程沖力過大丟失細胞；
6）通透時間一般為15-20min，過短過長效果均不好，應做不同時間梯度摸索。
七、IF常見問題總結
1）信號微弱或沒有信號
可能原因 | 解決方法 |
目的蛋白需要誘導表達或者表達量低 | 對于需要誘導表達的蛋白，參考文獻找到誘導蛋白表達的最佳處理條件和陽性對照；表達量低的蛋白考慮信號擴增，或與更亮的熒光基團配對；在可能的情況下，應使用蛋白印跡法或其他方法來確認蛋白表達情況 |
樣本保存不當。如熒光基團在光線下 暴露時間過長，可能會導致信號衰減 | 在避光條件下進行孵育和保存樣本。可在防淬滅的溶液中封固樣本。樣本封固后要立即采集圖像，以獲取最佳結果 |
細胞/組織樣本保存時間過長 | 使用新制備的樣本載玻片/板 |
固定不足 | 請參考產品說明書；處理后立即移除介質并在固定劑中快速清洗對于磷酸化特異的抗體，使用濃度為至少4%的甲醛來抑制內源性磷酸酶 |
抗體用量不合適 | 參見說明書建議的抗體稀釋濃度，并根據樣本表達量進行摸索 |
一抗孵育時間不合適 | 建議在4"C過夜孵育以獲得最佳結果 |
錯誤的通透方法 | 參見產品說明書中建議的提作步驟 |
二抗使用不當 | 按建議濃度使用，檢查二抗是否與一抗的宿主物種相匹配 |
錯誤的激發波長 | 確保激發和檢測(激光/激發/發射濾光器)與熒光基團激發光波長相匹配 |
2）高背景
原因 | 解決方法 |
封閉不充分 | 使用與二抗相同物種的正常血清，封閉1h |
抗體使用濃度過高 | 參考說明書推薦濃度，并根據蛋白表達量進行優化 |
抗體育時間過長或孵育溫度過高 | 參考說明書推薦的孵育時間和溫度 |
樣本變干 | 染色過程中，確保樣本始終漫沒在液體中 |
清洗不足 | 清洗以移除多余固定劑、多余二抗，以及結合松散、非特異性的抗體相互作用 |
樣本自發熒光 | 以未染色樣本為對照，檢測自發熒光程度。參考說明書推薦的固定劑，用久了的固定劑可能會出現自發熒光。更換陳舊甲醛、制備新鮮的稀釋液。使用在安瓶中新稀釋的、可用于電子顯微鏡（EM級）的戊二醛。為低豐度靶標選擇較長的波長通道 |
非特異性抗體結合 | 如可能，請與敲低(siRNA)或除細胞，或與已知靶抗原表達水平較高或較低的細胞進行比較 |
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