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如何用好HILIC，賽默飛幫您選擇色譜柱！
對于做液相色譜分析的人來說，我們先接觸到的往往是對于弱極性或者中等極性化合物的分離。對于這類化合物的分析來說，常用的是C8或者C18的反相色譜柱，而且對于這類化合物的方法開發及條件優化我們也都比較的熟悉。但是近些年來越來越多的人開始關注對極性化合物的分析，尤其是隨著對體內代謝物的研究不斷發展，對我們分析極性代謝物提出了更多的挑戰。
其實現在我們很多人也會采用反相色譜柱來分析一些極性化合物，比如流動相中加入離子對試劑或者采用一些極性封端的反相柱。當然這些比較經典的方法對于很多極性化合物的分析效果都是不錯的，但是都會面臨一些問題。
比如，加入離子對試劑，本身離子對試劑對于色譜柱的壽命會有一定的影響，流動相制備也相對復雜，另外很多時候也沒法與質譜兼容；采用極性封端類的柱子，流動相中會用到比較高比例的水，壓力會比較高，而且即使水相比例較高，對于一些很強極性的物質，仍然難以得到很好地保留。而HILIC可以克服以上的缺點，大大滿足您對極性化合物的分析要求。
什么是HILIC ？
HILIC是 Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography（親水作用液相色譜）的簡稱。我們首先要清楚，HILIC不是某個廠家的色譜柱系列或品牌，也不是某個鍵合相，它代表的是一種分離機理，而具備這種分離機理的鍵合相種類非常多。在HILIC中，固定相是極性的，流動相中的水相部分表現為強洗脫溶劑，這與傳統的反相色譜法*相反。
HILIC 發展歷史
HILIC分離模式早可以追溯到1951年，Gregor等人描述了一種離子交換樹脂表面的富水層概念，在1975年的時候，科學家在氨基柱上實現了糖類的分析也是屬于HILIC的機理，但是直到1990年科學家Alpert才正式提出了HILIC的概念,但是這時候HILIC并沒有得到廣泛的推廣，到了2000年以后，越來越多的人開始認識并使用HILIC機理進行極性化合物的分析，HILIC才得到了廣泛的認可。
HILIC 的作用機理
HILIC可以被認為是反相液相色譜通過采用極性固定相來運行的。HILIC中采用的流動相是含有少量水/緩沖鹽或其他極性溶劑的高比例有機相（>60%，常用乙腈）。流動相中的水形成一個富水層被吸附在固定相表面，極性物質首先進入富水層得到保留。極性化合物是通過一個復雜的混合模式被保留的，包括：富水層和流動相之間的親水分配、極性官能團和固定相間的氫鍵作用以及離子官能團的靜電作用。當然，親水分配是主要的保留模式。從保留機理來看，HILIC和反相色譜柱是有著非常大的差別的。
HILIC 流動相
HILIC常用的流動相是乙腈/水系統。比例：有機溶劑>60%，流動相中至少需要3%的水相（因為HILIC保留機理是通過形成富水層來實現的）。洗脫強度：四氫呋喃<丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇 <甲醇<水。對于條件摸索來說，等度條件下建議80%乙腈為起始條件來調整比例；梯度條件建議95%乙腈------60%乙腈。對于HILIC來說，我們有時也會在流動相中加入緩沖鹽，建議使用甲酸銨/乙酸銨（常用乙酸銨）緩沖液，可以同時滿足溶解度（醋酸鹽在高比例乙腈中溶解度較好）以及質譜檢測器兼容性的要求。
HILIC 固定相
上面我們提到，HILIC保留機理的固定相種類非常多。常用的包括：
1，裸硅膠（如賽默飛的Hypersil Silica, SyncronisSilica及Accucore HILIC等），這種固定相在HILIC中也是應用廣泛的固定相，未鍵合硅膠由于表面具有硅羥基，具有一定的陽離子交換活性，所以可以增強對堿性化合物的保留。
2，兩性離子固定相（如Syncronis HILIC）,此種固定相既有陽離子基團，又有陰離子基團，二者比例1：1，因此表面靜電荷為零。對于分析中性極性化合物是一個不錯的選擇。
3，酰胺鍵合相（如Accocore Amide HILIC）,通過丙基或者專有連接基團將酰胺官能團鍵合到硅膠表面，此種鍵合相能夠提供固定相和分析物之間的強有力的氫鍵作用，保留能力強，對于碳水化合物分析是一個不錯的選擇，如聚糖的分析。酰胺鍵合相不太容易產生不可逆吸附（氨丙基固定相經常會遇到這樣的問題），同時酰胺類色譜柱表現出良好的重現性和穩定性。其他的HILIC固定相包括：二醇基、氨丙基（氨基柱）、氰丙基（氰基柱）以及其他專有的特殊官能團鍵合相。
HILIC 的優勢及不足
通過上面我們介紹到的HILIC的機理及流動相和固定相的特征我們不難得出HILIC在分析極性化合物方面的優勢。首先，HILIC機理對于幾乎所有的極性化合物都有較好的保留，大大解決了我們分析極性化合物時遇到的難以保留的問題。其次，由于HILIC流動相有機相比例很高，所以對于質譜檢測器來說，可以確保去溶劑化，大大提高化合物的信噪比。另外，較高的有機相比例組成也會帶來更低的色譜柱壓力，在這個基礎上，我們采用小粒徑或者小內經的色譜柱時就不會受到壓力的困擾。
HILIC的優勢是很明顯的，但是對于任何一種分離手段，也都存在一些不足之處。由于HILIC保留機理比較復雜，所以在方法優化及色譜柱選擇上會比普通反相色譜柱要復雜。HILIC保留機理由于需要形成富水層，所以色譜柱平衡時間會稍長，建議是普通反相的2-3倍，當然，這個問題其實在反相采用離子對試劑分析的時候也會碰到。另外，由于極性化合物在水中的溶解性好，但是如果我們采用純水相來溶劑樣品的話，有時候會出現溶劑效應帶來的色譜峰展寬，就如同我們反相分析時用純有機相溶解樣品有時也會出現類似的問題。所以，建議采用純有機相或者與流動相比例接近的溶劑來溶解樣品。
通過以上關于HILIC的介紹，相信大家對HILIC有了更進一步的了解。在以后我們分析極性化合物方面又多了一個更有力的工具！