二級生物安全柜廣泛應用于微生物學、生物醫學、基因工程、生物制品等領域的科研、教學、臨床檢驗和生產中，是實驗室生物安全中防護屏障中基本的安全防護設備。如果使用不當，其防護作用就可能大大地受到影響。操作人員在移 動雙臂進出安全柜時，需要小心維持前面開口處氣流的完整性，雙臂應該垂直 地緩慢進出前面的開口。
手和雙臂伸入到生物安全柜中等待大約一分鐘，以便安全柜調整完畢并且讓里 面的空氣"掃過"手和雙臂的表面以后，才可以開始對物品進行處理。要在開 始實驗之前將所有必須的物品置于安全柜內，以盡可能減少雙臂進出前面開口 的次數。
物品放置二級生物安全柜前面的進氣格柵不能被紙，儀器設備或其他物品阻擋。放入安 全柜內的物品應采用70%酒精來消除表面污染。可以在消毒劑浸濕的毛巾上進 行實驗，以吸收可能濺出的液滴。
所有物品應盡可能地放在工作臺后部靠近工作臺邊緣的位置，并使其在操作中 不會阻擋候補格柵。可產生氣溶膠的設備（例如混勻器，離心機等）應靠近安全 柜的后部放置。像有生物危害性的廢棄物袋，盛放廢棄吸管的盤子以及吸濾瓶 等體積較大的物品，應該放在安全柜內的某一側。在工作臺面上的實驗操作應 該按照從清潔區到感染區的方向進行。 耐高壓滅菌的生物危害性廢棄物袋以及吸管盛放盤不應放在安全柜的外面，否 則在使用這些物品時雙臂就必須頻繁進出安全柜，這樣會干擾安全柜空氣屏障 的完整性，從而影響對人員和物品的防護。
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