產品介紹：

　DNA無縫克隆技術是一項簡單、高效、快速將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點的方法，本產品不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段酶切位點的限制，而直接使用同源重組的方法，采用特殊的酶將任意方法線性化后的載體與線性化載體兩端具有20-25 bp重疊區域的PCR片段定向重組，50℃反應5-15分鐘即可快速實現1-5個片段的定向無縫克隆。

產品名稱：康為世紀 快速DNA無縫克隆預混液

產品貨號：CW3034S

產品相關原理：

產品特點：

1.15分鐘可以將一個或者多個長、短PCR擴增片段（平/A端） 插入載體。

2.不受載體和插入片段酶切位點的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位點進行克隆。

3.無縫克隆，插入點不會引入不需要的堿基序列。

4.高效、準確，克隆陽性率＞95% 。

產品組分：

額外試劑需求：

1.插入片段，特異引物，線性化載體

2.高保真PCR試劑（推薦使用康為CW2965 Super Pfx MasterMix）

3.感受態細胞

4.膠回收試劑盒（CW2302 快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒）

5.PCR儀，PCR反應管等。

使用前準備:

線性化載體的制備回收

選擇合適的克隆位點對載體進行線性化，載體線性化方式有兩種：限制性內切酶酶切消化，反向PCR擴增。

a.酶切所得線性載體，單酶切或者雙酶切均可，酶切后推薦用PCR產物純化試劑盒或者膠回收試劑盒純化載體。因無縫克隆產品體系中沒有DNA連接酶，所以不會引起載體自連，重組產物轉化后出現的假陽性克隆 (無插入片段) 是由酶切不*未線性化環狀載體轉化而形成的，所以我們推薦酶切后膠回收純化，可以將未線性化載體比例降低到低程度。

b.反向PCR擴增得到線性化載體，推薦使用高保真聚合酶擴增，以減少擴增突變

的引入，使用環狀質粒為模板時，建議使用內切酶Dpn I對PCR產物進行消化，以減少環狀質粒模板殘留引起的克隆假陽性。如果使用Dpn I消化質粒模板，需80℃加熱20分鐘失活Dpn I活性，以避免重組反應時殘留Dpn I對克隆載體的降解。

相關使用說明：

1. 線性化載體與插入片段的使用量

載體一般用20-50 ng，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳；多片段連接的情況下，片段與片段之間摩爾比為1:1。

單片段克隆用量

最適克隆載體使用量=（0.02 x 克隆載體堿基對數）ng（0.03 pmol）

最適插入片段使用量=（0.04 x 插入片段堿基對數）ng（0.06 pmol）

多片段克隆用量（2-5個片段）

最適克隆載體使用量=（0.02 x 克隆載體堿基對數）ng（0.03 pmol）

每個插入片段的使用量=（0.02 x 每個插入片段堿基對數）ng（0.03 pmol）

輕輕混勻，在50℃水浴或者PCR儀中反應5-15分鐘，超過3個片段的連接，可以延長反應時間至30分鐘。反應結束后，將EP管置于冰上降溫后直接轉化或者保存于-20℃。

保存條件：-20℃，保質期一年。

產品訂購信息：

品牌             貨號                   名稱                                      規格

康為世紀  CW3034S  One Step Seamless Cloning Mix   20 rxns

產品名稱：康為世紀 快速DNA無縫克隆預混液

產品貨號：CW3034S

關于公司：

康為世紀是主要從事高附加值、高技術含量的生物試劑的研發與生產，為生命科學研究、基因檢測和體外診斷用戶提供創新型生物產品和服務。康為世紀建立了專業化、集約化、能夠形成自主知識產權的技術創新體系和開放式的合作創新平臺，構建成了公司完整的研發創新體系。

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紅榮微再作為RNA、NGS、ctDNA、qPCR的分子診斷專業供應商，以“傳遞科學價值，服務科學研究"為宗旨,努力為客戶提供質量可靠、貨美價優的分子診斷試劑耗材，與客戶攜手為中國分子診斷的發展而前行。