cyp3a65在斑馬魚中的時空表達及其對BDE47所致發育異常的影響

多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是一種運用廣泛的溴化阻燃劑,也是受到廣泛關注的持久性有機污染物。2,2’,4,4’-四溴聯苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE47)是從人類血液和母乳樣本中檢測到的含量豐富的PBDEs同系物,具有內分泌干擾效應,可引發生殖、發育、神經、免疫以及腫瘤等毒效應。研究表明,新生兒臍帶血中BDE47的濃度與其出生體重呈負相關,提示發育早期暴露于BDE47可能對胚胎發育造成損害,但BDE47所致發育毒性的機制尚不明確。生物轉化是外源化學物對機體產生毒性作用的重要過程,主要由細胞色素P450酶(Cytochrome P450,CYP450)介導。課題組前期研究證實,BDE47能被CYP3A代謝生成毒性更強的OH-BDE47,并通過引起氧化應激和細胞凋亡,進而產生毒性作用,但CYP3A的生物轉化在BDE47所致的發育毒性中的作用及其機制有待闡明。本研究運用BDE47染毒斑馬魚模型,敲降胚胎的cyp3a65,并運用經典抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和植物提取抗氧化劑異甘草素(ISL)進行干預,旨在探究cyp3a65(與人CYP3A4同源)在BDE47所致斑馬魚胚胎早期發育毒性中的作用及其機制。部分cyp3a65在斑馬魚胚胎的時空表達譜及BDE47的誘導作用目的:評估cyp3a65在斑馬魚胚胎的表達部位、表達量和表達時間以及BDE47對cyp3a65表達的影響,為評價BDE47對斑馬魚的發育毒效應提供依據。方法:運用原位雜交確定cyp3a65在0-168 hpf野生型斑馬魚胚胎的表達部位。通過檢測各時間點cyp3a65的轉錄水平,評估cyp3a65在0-168 hpf表達量的變化。建立BDE47(1μM)經水體染毒模型,運用原位雜交技術和Real-timePCR檢測cyp3a65在各時間點和器官表達量的變化。結果:斑馬魚胚胎整體原位雜交結果顯示,cyp3a65主要表達于斑馬魚的肝臟和腸道。cyp3a65從72 hpf開始微量表達,其表達量自96 hpf起明顯增加。Real-time PCR 結果也顯示,cyp3a6 的表達在 96-144 hpf 呈現顯著上升趨勢,但在144 hpf之后進入平臺期。1μM的BDE47能夠誘導cyp3a65表達。原位雜交實驗顯示,該誘導作用在72-120 hpf十分顯著,但在144-168 hpf,BDE47對cyp3a65表達量的影響不明顯。該效應同樣被Real-time PCR實驗證實,其原因可能是斑馬魚胚胎體內cyp3a65在144hpf的表達量已經達到了峰值。第二部分cyp3a65對BDE47所致斑馬魚胚胎發育異常的影響目的:評價BDE47對斑馬魚胚胎發育的影響以及cyp3a65在其中的作用。方法:運用嗎啉反義寡核苷酸(morpholino antisense oligos,簡稱morpholino)技術對斑馬魚胚胎的cyp3a65進行敲降。基于野生型(WT)和cyp3a65敲降胚胎(MO)建立BDE47(0、0.5、1.0μM)經水體染毒模型,觀察0-168hpf斑馬魚胚胎的主要毒性終點指標,包括自發活動、孵化率、畸形率、死亡率。此外,采用行為學分析系統檢測120hpf各組胚胎的平均運動速度、平均活動性和總移動距離,以此評估胚胎的神經發育狀態。通過對比BDE47處理下WT和MO組胚胎發育的表型差異,探究cyp3a65在BDE47所致斑馬魚胚胎發育異常中的作用。結果:與溶劑對照相比,BDE47沒有改變斑馬魚胚胎包膜內自發活動的頻率,但使斑馬魚胚胎在48-62hpf發生孵化延遲。此外,BDE47處理組胚胎從72hpf開始出現背向彎曲,畸形數量隨染毒劑量增加而增加。在168 hpf,0.5和1μM BDE47處理的WT組(BDE47/WT)胚胎畸形率分別約為27.8%和68.0%,而溶劑對照組沒有出現任何畸形胚胎。另外,BDE47組斑馬魚胚胎的死亡率也呈現出劑量和時間依賴趨勢,0.5和1μM處理組胚胎死亡率在168 hpf分別為6.4%和16.8%。然而,敲降cyp3a65后,暴露于5μMBDE47的MO組(BDE47/MO)胚胎畸形率始終低于WT組(120 hpf,18%vs 100%)。120 hpf胚胎的行為學分析結果顯示,對照組斑馬魚幼苗的平均運動速度在光照與黑暗中分別約為0.25 mm/s和2mm/s,BDE47/WT組的始終保持于0.8mm/s左右。然而,BDE47/MO組斑馬魚幼苗的平均運動速度恢復為在光照與黑暗中分別為0.4 mm/s和1.6 mm/s。此外,本實驗中胚胎運動的活動性和移動距離也呈現出類似速度的趨勢。對照組活動性和移動距離均在光照中低,黑暗中高,BDE47/WT組的活動性和移動距離始終保持于較低水平,BDE47/MO組的則恢復至接近對照組的水平。第三部分BDE47所致斑馬魚胚胎發育異常的氧化損傷機制目的:分析BDE47所致斑馬魚胚胎的氧化應激和細胞凋亡以及抗氧化劑干預對BDE47所致發育毒性的影響,探討氧化應激在BDE47所致斑馬魚胚胎發育異常中的作用。方法:運用BDE47和抗氧化劑(NAC或ISL)共同處理斑馬魚胚胎,分別檢測BDE47單獨或與抗氧化劑聯合暴露條件下,斑馬魚胚胎體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產量、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性,抗氧化相關基因(Cu/zn-sod、Mn-sod、Car)和細胞凋亡相關基因(p53、Bax、Bcl-2、caspase3、caspase9等)轉錄水平的變化,并且運用吖啶橙染色檢測斑馬魚胚胎整體的凋亡細胞。采用行為學分析系統檢測各組胚胎在120 hpf的平均運動速度、平均活動性和總移動距離,評價斑馬魚胚胎神經發育狀況。結果:1和10μMBDE47導致120hpf斑馬魚幼苗體內產生過量ROS,并呈現出劑量依賴性。BDE47能顯著下調抗氧化相關基因Cu/zn-sod和Cat的轉錄、上調Mn-sod的轉錄。同時,BDE47顯著降低抗氧化酶SOD和CAT的活性。此外,BDE47通過上調細胞凋亡相關基因p53、Caspase9、Puma,下調Bcl-2/Bax引起斑馬魚胚胎體內細胞凋亡。然而,抗氧化劑(NAC或ISL)顯著減少BDE47所致畸形數量。在120hpf,BDE47處理組畸形率高達90%,NAC/BDE47和ISL/BDE47聯合處理組的畸形率分別為30%和28%。NAC/BDE47和ISL/BDE47兩組抗氧化酶SOD和CAT的活性均明顯高于BDE47處理組。此外,NAC和ISL通過下調細胞凋亡相關基因p53、Bax、Caspase3和Caspase9的轉錄顯著減少暴露于BDE47的幼苗體內的凋亡細胞。行為學分析結果顯示,對照組斑馬魚幼苗的平均運動速度在光照與黑暗中分別約為0.45mm/s和1.5 mm/s,BDE47/WT組的始終保持于0.8 mm/s左右。然而,NAC/BDE47和ISL/BDE47組斑馬魚幼苗的平均運動速度恢復為在光照下0.7、0.5 mm/s,黑暗中分別為1.0、1.2mm/s。此外,幼苗運動的活動性和移動距離也呈現出類似速度的趨勢。對照組活動性和移動距離均在光照中低,黑暗中高,BDE47處理組的活動性和移動距離始終保持于較低水平,NAC/BDE47和ISL/BDE47組的則恢復至接近對照組的水平。結論本研究在評價斑馬魚cyp3a65表達的基礎上,利用敲降cyp3a65以及抗氧化劑,分別從生物轉化和氧化應激角度探討了 BDE47對斑馬魚胚胎早期發育的影響和機制,獲得了如下結論:1.cyp3a65主要表達于斑馬魚的肝臟和腸道,從72 hpf起表達,表達量隨時間推移而增加,在144 hpf達到峰值。BDE47能夠顯著誘導cyp3a65表達。2.BDE47導致斑馬魚胚胎暫時性孵化遲滯、畸形和死亡增加。BDE47所致斑馬魚胚胎畸形主要為背向彎曲,并可導致胚胎神經發育異常。敲降cyp3a65能明顯降低BDE47對胚胎的毒性作用,提示cyp3a65的表達能增強BDE47所致的斑馬魚早期胚胎孵育毒性。3.BDE47通過誘導胚胎內細胞產生過量ROS,激活p53/caspase信號通路,導致靶器官細胞凋亡,進而產生發育毒性。有效的抗氧化劑NAC和ISL能夠明顯減輕BDE47所致形態畸形和行為異常,提示cyp3a65介導的BDE47的胚胎發育異常以氧化損傷為主。