產品及特點

本產品是基于熒光染料檢測的即用型PCR試劑盒，可以對基因組DNA靶序列和RNA反轉錄后cDNA靶序列進行實時定量PCR分析（quantitative PCR、qPCR）。本產品含有經過優化的緩沖液組分、優化的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、SYBR Green I和穩定劑等成分。本產品中優化的Taq DNA Polymerase高溫加熱前，抗Taq 單克隆抗體與Taq結合，抑制Taq聚合酶活性，從而抑制在低溫條件下出現的由引物和模板DNA之間的非特異性雜交或引物二聚體引起的非特異性擴增。而且抗體在PCR反應的預變性步驟中能*失活，不會阻礙之后Taq DNA聚合酶的活性，大大提高了 PCR 反應的靈敏度及特異性。

• 方便，用戶只需準備模板和引物既可以進行實時定量PCR實驗和HRM（High Resolution DNA Melt Curve Analysis）分析。而基于SYBR Green I和LC Green染料的qPCR mix則不能同時用于上述兩種實驗。
• 使用抗Taq抗體封閉的優化的Taq DNA聚合酶，可抑制低溫條件下的非特異性擴增。
• 使用第三代飽和型熒光染料，信號強，不會抑制PCR反應。
• 快捷，即用型的預配液使加樣操作步驟大大簡化，避免了交叉污染，降低實驗誤差。
• 各成分的濃度和比例都經過精心優化，反應的靈敏度高，特異性強。能檢測到濃度為50拷貝/mL的靶分子。

規格及成分

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存, 保存期限為6個月。

自備試劑

DNA模板、引物、超純水。

使用方法

• 以20 uL的qPCR反應體系為例：在一干凈的PCR管中，加入下列成分：

放入熒光PCR儀中進行擴增, 并在退火或延長步驟中記錄熒光信號。

注意：

• 通常引物濃度以0.2 μM可得到較好結果，可以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考；通常DNA模板的量以10-100 ng基因組DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定*的模板使用量。
• ROX 校正染料：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三種型號的熒光PCR儀器，則需用自備的ROX進行Ct值校正。對ABI 7700和7900，ROX的*濃度為1×（即在每20 uL 反應體系中加2 uL 10×ROX）。對ABI 7500， ROX的*濃度為0.05-0.1×（每20 uL 反應體系加0.1-0.2 uL 10×ROX；也可將10×ROX稀釋到1×，然后每個反應體系加入1-2 uL 1×ROX）。ROX會在溶解曲線中產生噪音，因此，如果出現了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”選項取消打勾，然后重新分析數據。

對于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480等型號的熒光PCR儀器，ROX不是必須的，但加入的話也不會影響整個PCR分析。

• 循環步驟：根據擴增子的性質和儀器性能，從以下三個過程中任選一個進行擴增。

A：兩步快速循環法：適用于引物Tm值設計為60℃的反應

注意：本產品所采用的熱啟動酶須在預變性95℃、10 min條件下實現酶的活化。退火溫度請以60-64℃作為設定范圍的參考，發生非特異性反應時，可提高退火溫度。

B：三步快速循環法：適用于延伸步驟溫度高于退火步驟的PCR（長引物PCR）

注意：

• 退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應。若提高反應特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為設定范圍的參考。若因使用Tm值較低的引物等原 因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56℃-64℃的范圍作為設定參考。延伸溫度：延伸溫度設為72℃通常可以提高擴增效率。但是，對于AT含量大于70%的擴增子來說，延伸溫度設為60℃為宜。

C：通用循環法：這種循環方法適用于幾乎所有的熒光PCR儀，也適用于用快速循環法不能擴增的模版。

• 數據采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在沒結合DNA時，zui大吸收光譜在471nm，結合DNA時的zui大吸收光譜在500nm，zui大發射光譜在530nm。

其他注意事項：

• 如果使用iCycler，可以不加入FAM。
• 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛細管進行PCR，需加入終濃度為0.5mg/mL的自備BSA。

關聯產品

即用型PCR2.0、PCR級綠如藍染料。