本期為您推薦江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心副主任周景文教授團隊發(fā)表在Synthetic and Systems Biotechnology上面的一篇文章：Synergetic engineering of Escherichia coli for efficient production of L-tyrosine。本研究通過協(xié)同工程策略，針對莽草酸途徑并微調(diào)代謝過程，并利用實驗室適應(yīng)性進化（MMC）提高菌株對酸性條件的耐受性，最終獲得了一株優(yōu)化的菌株，在5升發(fā)酵罐中62小時內(nèi)能夠產(chǎn)生92.5 g/L的L-酪氨酸，對L-酪氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)有著重要的意義。
L-酪氨酸在食品、飼料、化工和制藥行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，它不僅是多種天然產(chǎn)物的前體，如咖啡酸、類黃酮和姜黃素等，還涉及治療帕金森綜合癥的藥物L(fēng)-DOPA的合成。盡管L-酪氨酸具有重要的工業(yè)價值，傳統(tǒng)化學(xué)合成或者酶促法生產(chǎn)酪氨酸的工藝存在成本高和穩(wěn)定性差的缺點。微生物發(fā)酵法產(chǎn)酪氨酸具有成本低，操作簡單等優(yōu)勢，但是也存在產(chǎn)量較低，高密度發(fā)酵菌株不夠穩(wěn)定等缺點。
研究人員以大腸桿菌WSH-Z06作為起始菌株，對莽草酸和芳香氨基酸積累相關(guān)的幾個基因進行過表達(dá)和敲除混合驗證，得到一株聯(lián)合4個基因過表達(dá)與3個基因敲除的菌株，48 h搖瓶L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到4.22 g/L（圖2 ）。接著在其莽草酸途徑中添加磷酸解酮酶途徑（PK），發(fā)現(xiàn)菌株在搖瓶中的OD600提升了9.8%，但是整體的L-酪氨酸產(chǎn)量呈現(xiàn)降低趨勢。整合2個NADH與NADPH互相轉(zhuǎn)化的基因后，得到的菌株產(chǎn)量提升至6.17g/L（圖3a）。將該菌株進行5L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵，L-酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到50.2 g/L，同時在發(fā)酵液中檢測到12.4 g/L的乙酸（圖3b），高濃度乙酸導(dǎo)致了菌體生長被明顯抑制（圖3b）。
為了減少乙酸的累積，對大腸桿菌乙酸生產(chǎn)途徑基因進行敲除，得到的菌株乙酸產(chǎn)量下降33.6%，菌體生長略有改善。進一步提升其對乙酸的耐受性，提高賴氨酸產(chǎn)率，利用MMC（微生物液滴連續(xù)傳代進化儀）進行適應(yīng)性進化，在液滴體系下對超過200個液滴進行50次傳代篩選，不斷提高乙酸濃度，得到在pH 5.1下生長良好的菌株，最好搖瓶水平產(chǎn)量為7.11 g/L（圖4）。通過在5L發(fā)酵罐中控制葡萄糖濃度與溶氧，最終L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到92.8 g/L。
這一系列綜合的工程策略顯著推進了L-酪氨酸在微生物合成中的產(chǎn)量，為工業(yè)級生產(chǎn)提供了有力的實驗支持。
圖1 葡萄糖生物合成L-酪氨酸途徑
圖2 敲除和過量表達(dá)基因后賴氨酸的產(chǎn)量
圖3 優(yōu)化菌株搖瓶與5L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果
圖4 大腸桿菌乙酸體系改性及耐酸性進化
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.synbio.2023.10.005
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