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熒光定量pcr儀工作原理

閱讀:2991      發(fā)布時間:2019-8-22
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將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后,完成高溫變性,低溫復(fù)性,適溫延伸的熱循環(huán),并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律,與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷,熒光素游離于反應(yīng)體系中,在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長,通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度,求得Ct值,同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照,即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。

  Ct值(Cyclethreshold,循環(huán)閾值)的含義為:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

  1. 熒光閾值(threshold)的設(shè)定

  PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光閾值的缺省(默認)設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,即:threshold= 10*SDcycle 3-15

  2. Ct值與起始模板的關(guān)系

  每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,公式如下。

  Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

  n為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù),X0為初始模板量,Ex為擴增效率,N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。

  起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

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