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內毒素檢測的基礎知識
閱讀：3160 發布時間：2019-3-5
1. 什么是內毒素？
內毒素一種在革蘭氏陰性菌細胞壁中發現的脂多糖（LPS）。它是一種典型的熱原，哪怕是皮克級（10-12 g）或納克級的（10-9 g）內毒素進入血液，也會引發各種生物反應。因為其有著耐熱性和穩定性，通過高壓蒸汽處理也不能*使內毒素滅活，需在250℃或以上的溫度下，干熱處理至少半小時才能使其滅活。它存在于革蘭氏陰性菌棲息的環境中（例如水，空氣），即使在細菌死亡后，細菌性的內毒素（LPS）仍然存在。
圖1為脂多糖的結構圖，如圖所示，脂質A在該物質中是負責生物活性的主要部分，這部分的分子量約為2000。包含糖鏈部分在內的整個分子的分子量一般為5000到8000左右。然而，因為內毒素是一種同時擁有親水區（糖鏈）和疏水區（脂質A）的分子，它能在水溶液中相互締合，形成表觀分子量為數十至數百萬的膠束結構。有報告指出，膠束結構的變化，會影響其生物活性的強弱。
圖2所示為大腸桿菌型和沙門氏菌型的脂質A的結構。從圖中能看出即使菌株不一樣，脂質A的基本結構在大體上仍然相同。
圖1. 脂多糖（LPS）結構示意圖
圖2. 脂質A的結構（大腸桿菌型和沙門氏菌型）
2. 使用鱟阿米巴樣細胞溶解物（LAL）試劑的各種內毒素檢測方法
由馬蹄蟹（美洲鱟）的阿米巴樣細胞溶解物制備的試劑可用于檢測細菌內毒素。如圖3所示，在內毒素的參與下，級聯反應開始進行，其中C因子，一種絲氨酸蛋白酶前體，先被活化。隨后接下來的是B因子的活化，B因子也是一種絲氨酸蛋白酶前體和凝固酶前體，它能將凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝膠。在LAL測試中，內毒素可以通過三種方式定量：對凝膠的形成進行測定，對濁度的增加進行測定，或對由合成底物分解而釋放出的黃色的色原體進行測定。
普通的LAL試劑不僅與內毒素反應，而且會與（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌細胞壁成分）反應，因為G因子途徑會在LAL試劑作用下被激活。為了消除這種（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工業中通過去除G因子或抑制其活化，開發了各種內毒素特異性試劑。
市場上有著各種基于圖3中的反應機理所制得的LAL試劑以及檢測體系。因此，根據所需的準確度、測試頻率、樣本數目以及其他相關因素來選擇合適的產品是十分重要的。
圖3. LAL試劑反應機理
美國，歐洲和日本的藥典中包含了三種內毒素檢測方法，分別是凝膠法、比色法和比濁法，我們會在下面的章節中詳述，并且會介紹相關的LAL試劑的特點以及其應用實例。
(1) 凝膠法
將樣本與LAL試劑在試管中混合，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2min，期間不要振動。加熱完成后，立即緩慢地將試管傾斜180°。如果凝膠已形成并能保持其完整性而不變形或塌陷，則結果可確定為陽性，而如果未形成凝膠則為陰性。在檢測期間，對于一系列樣本，要進行多倍稀釋（通常為2倍），以檢查每個樣品的結果是否為陽性。確定為陽性的大有效稀釋倍數或小濃度被稱為終點。
相關試劑
在單次型試劑盒和多次型試劑盒中都包含LAL試劑，其中單次型試劑盒中的反應小瓶包含了預分裝好的用于單次檢測的LAL試劑，而多次型試劑盒則是將所需量的已經溶解好的LAL試劑裝入到反應瓶中。單次型試劑盒非常適用于少量樣品的檢測，而多次型試劑盒則適用于樣本量更多的檢測。
多次型試劑盒的使用方法式是將0.1mL已經溶解好的LAL試劑分裝到反應管中，然后再加入0.1mL樣品，并將其混合。而單次型試劑盒的使用方法則是將0.2mL樣本加入到含有預先分裝好的LAL凍干試劑的反應小瓶中。
ES-II系列
特異性內毒素LAL試劑（不會被（1→3）-β-D-葡聚糖活化），與細菌內毒素檢測（BET）（日本藥典）相兼容。其膠凝靈敏度為0.015 EU/mL，單次型和多次型試劑盒均有提供。
（2）比色法
由于內毒素會使LAL試劑活化，比色法是根據其對顯色底物的分解來檢測其活化。由于對硝基苯胺的黃色的吸光度是在405 nm波長下檢測的，如果樣品在約405 nm波長下具有相當大的光吸收，則不宜使用比色法。
相關試劑
Color KY 系列
內毒素特異性比色法LAL試劑，與BET（日本藥典）一致性測試相兼容。與Toxinometer® 結合使用的單次型試劑盒，以及與酶標儀和Toxinometer® 結合使用的多次型試劑盒，可用于動態比色測試。這些系列在我們的試劑產品有著較高的靈敏度：檢測限為0.0002 EU/mL（單次型）和0.0005 EU/mL（多次型）。
（3）比濁法
比濁法利用凝膠濁度的變化來檢測由內毒素誘導所產生的LAL試劑的活化。它不適用于具有一定濁度的樣品。
相關試劑
ES-F系列和ES-II系列
在動態比濁法測量中，可以將ES-F系列、ES-II系列與酶標儀和Toxinometer® 結合使用。這些試劑盒不僅能獲得凝膠法的結果，同時能得到動態比濁法的數據，測量時間為60 min。
3.對檢測用具的要求
用于內毒素檢測的所有檢測用具必須不含內毒素和β-葡聚糖。為使內毒素失活，需要在250°C下干熱處理超過30 min。建議使用經干熱滅菌的玻璃器皿。避免使用金屬工具，因為即使有少量被洗脫出的金屬離子（例如鐵，鋁，鎵，鉻），也可能影響測試。而當使用一次性塑料工具（其制造商未能保證其能用于檢測用途）時，檢查它們是否滿足以下要求（與玻璃器皿相比）：1）未被內毒素污染; 2）不吸附內毒素; 3）無洗脫物。
4.內毒素標準品
根據檢測目的使用適當類型的內毒素標準品。
•需符合BET（美國藥典/ 歐洲藥典 / 日本藥典）的檢測，例如藥品和醫療器械的產品終檢驗
→必須使用美國藥典，歐洲藥典或日本藥典標準的內毒素國家標準品。
•對材料，工藝流程和其他相關主題的檢測
→可以使用內毒素工作標準品（CSE）。
5. 樣本干擾
有時候需要采取預防措施，以防止樣本對內毒素檢測有潛在影響（反應干擾）。這些干擾分為以下兩種類型：
（1）對LAL試劑的干擾
•蛋白變性劑（例如酸，堿，尿素，表面活性劑，有機溶劑）
•蛋白酶和蛋白酶抑制劑
•螯合劑（會清除反應所需的鈣和鎂）
•對于比色法：著色物質（在約405 nm處具有相當大吸收的物質）
•對于比濁法：濁度
（2）對內毒素的干擾
•金屬離子（例如鐵，鋁，鎵和鉻離子。即使微摩爾級別的存在也會對測試產生影響）
•表面活性劑
樣本的干擾效果可以通過進行藥典中的干擾因子測試來衡量：即通過對加標了已知量的內毒素的樣本進行檢測，獲得加標內毒素的回收率。如果回收率在50％至200％范圍內，則可以確定該樣本不會造成影響，換句話說，檢測所得的內毒素濃度是正確的。如果發現樣本會造成影響，可以通過對樣本溶液進行稀釋，從而減少對測試的影響。然而，對樣本溶液的稀釋會提高了由原始溶液（預稀釋溶液）的濃度轉換而得的內毒素濃度值。合理的稀釋倍數（大有效稀釋倍數），是根據待檢測的內毒素的所需濃度以及所用LAL試劑的檢測靈敏度來確定的。欲了解反應干擾因子和大有效稀釋度的詳細信息，詳見藥典中的細菌內毒素檢測。
6. Limulus ES的原理（內毒素特異性試劑）
圖4. 鱟試驗反應級聯
LAL試劑和內毒素的級聯反應機制如圖4所示。如果反應體系中存在（1→3）-β-D-葡聚糖*，會激活G因子，引起伴有凝膠化的假陽性反應。在這種情況下，無論體系中是否存在內毒素，都會發生反應，意味著無法對內毒素進行特異性檢測。為此，我們研發出Wako's Limulus ES，該產品通過在反應體系中加入過量共存的（1→3）-β-D-葡聚糖（羧甲基化凝膠多糖），從而來抑制（1→3）-β-D-葡聚糖的干擾。因此，β-葡聚糖對LAL試劑的活化受到抑制，從而使內毒素特異性檢測能夠進行。過量的β-葡聚糖可以抑制其自身反應的原理如圖5所示：β-葡聚糖和LAL試劑之間反應的濃度范圍對于整個反應而言很窄。另一方面，內毒素和鱟試劑的反應在很寬的濃度范圍內都會發生，并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干擾。Wako的Limulus ES就是根據這個原理而制作的（見圖6）。
*（1→3）-β-D-葡聚糖來源于霉菌（真菌）或經纖維素濾膜過濾所得。
圖5. 羧甲基化凝膠多糖和LAL反應
使用Toxinometer®（檢測時間設定為99 min）和Limulus HS進行檢測。
○在99 min內檢測不到凝膠的生成
●有凝膠的生成
圖6. 羧甲基化凝膠多糖對使用Limulus HS和Limulus ES進行的內毒素檢測的影響
A：Limulus HS
B：Limulus ES
○內毒素的系列稀釋
▲含有1 μg/mL羧甲基化凝膠多糖的內毒素系列稀釋
◆產品列表
產品編號 | 產品名稱 | 規格 | 包裝 |
295-72301 | Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL） | for Endotoxin Detection | 25 tests |
291-75701 | Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F MULTI TEST (without CSE) | for Endotoxin Detection | 100 tests |
295-51301 | Limulus ES- II Single Test wako | for Endotoxin Detection | 25 tests |
299-51201 | Limulus ES- II Test wako | for Endotoxin Detection | 60 tests |
292-51213 | Limulus Amebocyte Lysate ES-II，Lyophilized | for Endotoxin Detection | 2 mL×5 |
293-75401 | Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (with CSE) | for Endotoxin Detection | 160 tests |
297-75301 | Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (without CSE) | for Endotoxin Detection | 200 tests |
291-53601 | Limulus Color KY Single Test wako | for Endotoxin Detection | 25 tests |
291-53101 | Limulus Color KY Test Wako | for Endotoxin Detection | 60 tests |
290-33771 | Toxinometer® ET-6000/J Standard Set | — | 1 set |