隱孢子蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

Cryptosporidium spp.

產品及特點

隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）為體積微小的球蟲類寄生蟲,廣泛存在多種脊椎動物體內，寄生于人和大多數哺乳動物的主要為微小隱孢子蟲，由微小隱孢子蟲引起的疾病稱隱孢子蟲病，是一種以腹瀉為主要臨床表現的人畜共患性原蟲病,會給人體健康帶來嚴重損害，因此快速檢測隱孢子蟲具有重要意義。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測隱孢子蟲的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.引物和探針經過優化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據人隱孢子蟲高度保守區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。
5.本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
6.本產品只能用于科研。

隱孢子蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑  DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼 容。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個 用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好 后后加）：

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：
五、數據處理
12.以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
六、電泳檢測
13..如果有必要電泳確認，可取10-20 uL PCR產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實驗環境，建議不輕易采納。