牛呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Bovine Coronavirus(BCoV)

產品及特點

呼腸孤病毒是具分節段的雙鏈 RNA 基因組的一類病毒，分布廣，病毒粒呈球 形，大小在 60-80 納米之間的 20 面體結構。本產品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發，專門檢測牛呼腸孤病毒的試劑盒。它具有下列特點：

1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據牛呼腸孤病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規 RT-PCR 高 10-100 倍，可以達 到至少 1000 拷貝/反應。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術，RT 和 PCR 兩步在一個試管內完成，不需要中 間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

牛呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。陽性對照需要因易污染其他成分需 要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 RNA 段作為陽性對照。 

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行）。為增加產品穩定性和避免擴 散傳染性病原。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重 復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

5. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性 對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的陽性對 照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷 貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣 品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。

6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。

三、設置 RT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用 于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如 果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用 于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用 于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析 的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

8. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置 完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。

 按儀器預設程序進行熔解曲線分析

四、數據處理

10. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于 或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等 于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。