雙歧桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Bifidobacterium spp.

產品及特點

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類存在于人體中非常重要的專性厭氧菌，于 1899 年首先在母乳喂養的健康嬰兒糞便中發現并分離，研究證實雙歧桿菌具有平衡腸 道菌群、降膽固醇、延緩衰老及抗腫瘤等生理功能，是人體益生菌群的主要組成。添加 雙歧桿菌的微生態制劑開發研究已成為一大熱點，廣泛應用于食品、保健和醫療等領域。 但不斷有報道指出國內外市場上雙歧桿菌微生態制劑標示名稱混亂，很多國家市場上雙 歧桿菌制品假冒代替現象嚴重。針對該現象，開發了針對雙歧桿菌特異性檢測試劑盒， 本產品利用實時熒光定量 PCR 技術，通過熒光染料實時顯示樣品雙歧桿菌模板 DNA 的量, 并通過坐標曲線表示出來, 結果直觀準確。它具有下列特點： 

1. 根據雙歧桿菌屬 tuf 基因，設計的針對雙歧桿菌的 PCR 引物，克服了其他細菌的 干擾。

2. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。

3. 熒光定量 PCR 檢測，反應特異性強。

4. 本試劑盒可以進行 100 次 20uL 體系的 qPCR 反應。

5. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

雙歧桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒規格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存(B 袋的陽性對照一定要放擴增區，A 袋的試劑放樣品準備區)，有 效期一年。 

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化雙歧桿菌樣品的 DNA，

二、引物的制備（在樣品制備室進行）

2. 按引物標簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見引物試管上 的標簽），使得兩條引物的濃度均為 10 uM（10pmol/uL）。

三、稀釋陽性對照（以 10E3-10E7 這 5 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體菌做陽性對照，只 提供可以直接使用的長為 339bp 的 DNA 段作為陽性對照。

3. 標記 5 個離心管，分別為 7，6，5，4，3 號。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 先將本試劑盒提供的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照用超純水 10 倍梯度稀釋到 10E8 拷貝/μL。放冰上待用。

6. 在 7 號管中加入 5 μL 10E8 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用

 7. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

8. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 10E6 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

9. 換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 10E5 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

10. 換槍頭，在 3 號管中加入 5 μL 10E4 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E3 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用

三、設置 PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

11. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次。樣品管 和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有成分蓋上蓋子 儲存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行 優化）。 

13. 數據采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時， 大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發射光 譜在 530 nm。

四、數據處理

14. 以 Tuf 基因序列陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。 再以待測樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值計算出樣 品 DNA 的濃度。