原代肝細胞培養方法總結

1、肝細胞培養液的組成（以100ml培養液為例）：
DMEM90ml，10%胎牛血清10ml，肝細胞生長因子1-2ug，雙抗（100乘）1ml，胰島素500U/L、地塞米松0.4mg/L
關于培養液添加內容的解釋：
肝細胞培養液中是否要添加肝細胞生長因子
重組人肝細胞生長因子(r—hHGF）是zui強的促肝細胞分裂劑，在一定劑量范圍內，r—hHGF與肝細胞DNA的合成有明顯的量效關系。
肝細胞生長因子的劑量問題：1ng/ml r-hHGF即可引起DNA合成顯著增加；10ng/ml時DNA合成效應zui大，繼續增加r-hHGF的劑量會出現抑制效應。
該實驗結果可觀察到，r-hHGF5ng/ml的刺激效應與10ng/ml的相差無幾。這提示我們，為了節省試劑，在以后的實驗中可采用5ng/ml的劑量。Strain等研究證明 ]，從人血漿中提取并純化的hHGF刺激原代培養大鼠肝細胞合成DNA的半zui大劑量為1—2 ng／ml(1O一20 pmol／L)
肝細胞生長因子作用時間的問題;表現為r-hHGF作用24小時，DNA 合成量明顯高于對照組（P＜0.01），48小時作用達zui高（P＜0.001），隨后開始下降，至96小時下降到相當于24小時的水平。（肝細胞生長因子刺激大鼠離體肝細胞DNA合成的劑量一與時間一效應）
青霉素100u/ml,鏈霉素100ug/ml：防止污染
胰島素10-8mol/L，地塞米松10-6mol/L促進貼壁
組織塊法肝細胞分離：
采用胰酶、膠原酶兩步消化法和低速多次離心法進行肝細胞分離。將出生后第3天的SD大鼠斷頭處死放入750ml/L乙醇中消毒10min，無菌采取肝，置冰冷PBS中，撕去肝包膜，剪碎后加入0.5mg/L的胰酶中37℃振蕩消化20min，棄去上清后，再用2mg/L的IV型膠原酶37℃振蕩消化20min，用含10% 胎牛血清的DMEM-HG終止消化，吹打2min，靜置使肝組織塊沉于消化瓶的底部，取上清收集細胞懸液，以800r／min離心5 min，棄上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM-HG培養液，調整細胞濃度以5×10／ml接種于50ml培養瓶內，37"C、5 %C02、飽和濕度靜置培養。用200目孔徑網篩過濾，細胞懸液在4℃條件下800r/min離心3min，反復離心3次。沉積的細胞用含100ml/L胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度為5*105/ml,臺盼藍染色測定肝細胞活力。將調整好密度的細胞接種在膠原包被的培養板中，培養24小時后換液，去掉紅細胞。采用過碘酸-雪夫反應鑒定肝細胞。
2.取肝細胞注意事項
取大鼠肝臟細胞前需要禁食12h
非灌流分離肝細胞法，該法直接將離體肝臟置于冷的培養基中，切碎，加入溶解酶破換肝細胞間連結，再經過振動、沉淀，zui后在上清液中得到游離的肝細胞。（游離肝細胞培養技術在肝臟毒理學研究中的應用）
洗滌液D-hanks液，用眼科剪剪成1mm3左右的碎塊，使其成糊狀。
3、肝細胞培養過程中造成肝細胞損傷的問題
原代培養的大鼠肝細胞的代謝功能較其他細胞更為敏感，本實驗中由于肝細胞分離時細胞膜完整性的損傷，細胞需要在體外逐漸的修復，在培養第3天細胞活力（MTT實驗A值zui大）達到高峰，合成和分泌功能完好，LDH漏出也較低，細胞達到*狀態，與其他研究結果一致。（全反式視黃酸對大鼠原代肝細胞鐵代謝的影響）
4、臺盼藍染色的濃度
0.4的臺盼藍，達90%以上用于實驗（兩步灌流法）（肝細胞生長因子刺激大鼠離體肝細胞DNA合成的劑量一與時間一效應）
 

Trypan blue （臺盤蘭）排斥實驗：
細胞懸液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理鹽水溶液0.1ml,混勻后滴在血球記數板上。存活率=不著色細胞數/細胞總數X100%

5、取肝細胞注意事項
取大鼠肝臟細胞前需要禁食12h
非灌流分離肝細胞法，該法直接將離體肝臟置于冷的培養基中，切碎，加入溶解酶破換肝細胞間連結，再經過振動、沉淀，zui后在上清液中得到游離的肝細胞。（游離肝細胞培養技術在肝臟毒理學研究中的應用）
洗滌液D-hanks液，用眼科剪剪成1mm3左右的碎塊，使其成糊狀。
6、肝細胞培養過程中造成肝細胞損傷的問題
原代培養的大鼠肝細胞的代謝功能較其他細胞更為敏感，本實驗中由于肝細胞分離時細胞膜完整性的損傷，細胞需要在體外逐漸的修復，在培養第3天細胞活力（MTT實驗A值zui大）達到高峰，合成和分泌功能完好，LDH漏出也較低，細胞達到*狀態，與其他研究結果一致。（全反式視黃酸對大鼠原代肝細胞鐵代謝的影響）
7、Pereol1分離液：Pereol1分離液以9份Percoll原液，加入1份10 X PBS，制成緩沖的Percoll液，再用1 X PBS調整Percoll液密度為1．08—1．09 kg／L。若肝細胞的活率在90％以下，則加用Percoll細胞分離液進一步純化。8 mL肝細胞懸液懸浮于密度為1．08—1．09 kg／L的20 mL Percoll液上，5 000 r／min離心5 min，棄上清，PBS清洗肝細胞1次，500 r／min，3 min。
肝細胞的接種 活力在90％ 以上的肝細胞按1 X l05密度接種兩組6孔板，每孔加入3 mL Hepa．toZYME—SFM肝細胞培養液，于37℃ 、5％co2條件下培養。培養4—6 h待肝細胞貼壁后即更換培養液，其后每3 d換液1次。（長期培養的大鼠原代肝細胞功能和形態學觀察）
8.（1）培養瓶紫外過夜，高壓后的1×PBS 10ml備用
（2)計算膠原溶液濃度：查文獻得膠原濃度為10μg/cm2（儲存濃度為4mg/ml),一般中等大小的培養瓶為25cm2，計算[(10×1/1000 mg/cm2)×25cm2]/4mg/ml可得出每個培養瓶需要的膠原量
(3)先在高壓后15ml離心管內加入5ml 1×PBS，再用槍吸取計算好的膠原用量，注入PBS里，混勻
(4)將配好的膠原溶液緩緩注入培養瓶中，將培養瓶水平放在超凈臺里，可用紫外照，15－30min后，將PBS貼壁吸出，盡量吸干凈，再將培養瓶放入超凈臺里照紫外，等膠原干后即可使用。
(5)如果放在超凈臺里保存，一周內仍可有效。注：1、所有操作均在超凈臺里無菌操作2、膠原為collage type I(Upstate）液態濃度為4mg/ml，無菌。3、PBS新鮮配置，高壓后放在超鏡臺里冷卻至室溫
(6)膠原一定要充分混勻，否則鋪板時凸凹不平
(7)膠原包被后，不要用紫外線照，會破壞膠原結構，注意無菌操作即可。2。使用前，用溫熱的不含血清的培養基洗一次后，再用。

膠原包被后應該晾干，因為膠原一般是用0.01%醋酸配制，如果包被后沒有自然晾干，會使培養基變酸。自然晾干后可以保證膠原*吸附在培養皿或培養瓶上，而且多余的醋酸可以揮發，不會影響培養基的PH值。別忘了加分

我用培養皿，包被后超凈臺內開蓋開紫外燈~

膠原用三蒸水溶即可，4mg用16ml溶，終濃度250ug/ml，4度保存用時每10ml培養液加0.1ml，配成2.5ug/ml含膠原培養液來包被包被后敞開在紫外燈下照射一小時即可.
9.肝細胞純化采用差速離心法：800轉，4℃，3min
10.鑒定我采用的是糖原染色和免疫熒光（ck18）