免疫組化染色過程中存在的問題

良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結果的基礎和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環 節，每一個步驟或環節都可能影響到染色的zui終結果，因此，要做好一張高質量的免疫組化切片并不是一 件非常容易的事。需要病理技術員和病理醫生密切配合、相互協調、共同努力才能保證做出合格的免疫組 化切片。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問題，但從染色的結果看，一般可分為兩類：無色片（即 無陽性信號）和“雜音”染色片（有陽性信號）。 一、 無色片 染色結束后，切片中見不到任何陽性信號。這是常規工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩種可能： 1、真陰性結果：整個染色過程沒有出現問題，組織或細胞確實不表達與抗體相關的抗原。2、假陰性結果： 即此陰性結果不是真實的反映。假陰性結果又可分為兩種情況：（1）、切片中根本就不包含所預期檢查的組 織或細胞。出現這種情況，要麼是病理醫生選擇錯了切片或抗體選錯了，要麼是技術員選錯了蠟塊。獲得 正確的切片進行染色是獲得正確結果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術員的事， 病理醫生也起著*的作用。（2）、染色過程中的某一或某些環節出了問題。比如，組織未進行抗原修 復，有的組織必須經過抗原修復才能檢測抗原表達；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織 的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長 期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環節，如忘記加二抗或三抗，或 用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制 DAB 時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法： 在三抗孵育結束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的 DAB 滴一滴在白紙的三抗上，觀察是 否出現棕色。如果出現了，證明三抗和 DAB 的配制過程沒有錯誤。如果這種 DAB 再滴到切片上沒有出現 任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗 DAB 或 DAB 的配 制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現問題可能的原因。 解決陰性染色的問題非常簡單，就是設立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達，說明染色的全過程 和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細胞沒有相應的抗原表 達。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應一一尋 找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在 已知的抗原，如正常淋巴結中存在 T 和 B 細胞抗原，CD20或 CD3都應該有表達。自身對照是一種比較理想 的對照，對照和測試組織或細胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結果更可靠也更具有可比 性。在選擇自身對照片時選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為 “外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用 HMB45或 Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關的抗原，如果病變出現陽性反應結果，尚能提 示是惡黑，但是如果出現陰性結果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術問題。因此， 應另外設立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實際工作中需要 設立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。為了解決這個問題， 目前國內外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等， 其連續切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性 對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質、神 、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。 設立陽性對照是病理醫生的任務或責任，而不是技術員的責任。病理醫生觀察了 HE 切片，了解切片中 是否有自身對照，如果沒有，就應告訴技術員采用陽性對照。因此，病理醫生在免疫組化中的作用是不可 忽視的。 抗體未覆蓋上測試組織：當多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。 二、“雜音”染色片 免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音” 染色。“雜音”染色種類繁多，產生的原因也多種多樣，為了便于說明，筆者將其歸納為下面幾種 1、 全片著色 全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是 陰性。出現這種現象的原因有： （1） 抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工 作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如 此，不能只簡單的按說明書進行染色。 （2） 抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，隨身佩帶報時表或報時 鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的 時間不是傳統的1小時，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。 （3） DAB 變質和顯色時間太長：DAB 現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的 DAB 不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產生反應而降低 DAB 的 效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB 的顯色在顯微鏡 下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實， 但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。 （4） 組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等 都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫圈，可 以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。 （5） 切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗 室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在 4ºC 冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此， 不可存放時間太長。 （6） 一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新 買的抗體時設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。 2、 切片邊緣著色 切片邊緣著色也是一種常見的現象，這種現象稱為邊緣效應。產生的原因： （1） 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。 解決辦法：制備的膠片（APES 或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處 理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織。 （2） 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解 決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2 mm。用 DAKO 筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應 距組織邊緣3-4 mm。 3、“陰陽臉”著色 指組織一半著色一半無著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結果。其成因是試劑僅覆蓋了部分 組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應該在加完試劑后，仔細看一遍， 是否有的組織未被試劑*覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之 將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但后來試劑流向一邊， 部分組織未被試劑覆蓋。對于這種問題，只要留心或想到了很容易發現，也很容易解決。有時，用 DAKO （或 PAP）筆在組織周圍畫圈時，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學原理，試劑不能達到靠近 劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽分明的著色，只是不著色區域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被 推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決辦法是滴加試劑時手法要輕，有氣泡時用牙簽捅破。 4、 灶片狀著色 切片中著色區東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現這種問題的原因有： （1） 裱片時水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時試劑滲入后不易洗盡，顯色過深所致。解決 辦法是，漂片盒里的氣泡應去盡，晾片熱臺不能平放，應有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發。 （2） 壞死組織灶，組織壞死后細胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復雜的肽鏈殘段（如 Fc 段）可能 與一抗或/和二抗結合導致zui終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的切片。 （3） 制作 APES 膠片時，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決辦 法是按照標準的制備方法進行，即5%鹽酸酒精（5ml 鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水沖洗玻片 1小時、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2 ml APES+98 ml 丙酮） 浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37°C 過夜干燥、室溫儲存 備用。如果制片過程中，因丙酮逐漸揮發而膠變濃時可適當加入一些丙酮。 5、 間質著色 著色部位主要在間質，間質著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質因蛋白疏水基團相互作用形成非特 異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結合。又如血清中的免疫球蛋白 常常滲出到組織間質，很容易與抗體結合，造成間質著色，特別是 lambda 和 kappa 染色時。當甲狀腺膠 質外溢到組織間質時，做甲狀腺球蛋白染色也會出現間質著色。抗體不純或抗體被污染也可出現間質著色， 我們曾遇到 CD20抗體不純，除了染上 B 細胞外還染上了間質。 6、 細胞漿著色 胞漿著色是所有“雜音”染色中有欺騙性的著色，著色區局限在細胞內，間質無著色，看上去與 真實的免疫反應著色幾乎一樣，很難區別。胞漿里含有較多的蛋白質，因此，很多非特異性的染色除了見 于間質也可以出現在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過血清封閉解決。還有因內源酶造成的著色， 如血紅蛋白（紅細胞）、肌紅蛋白（肌細胞）、細胞色素（粒細胞、單核細胞）、過氧化氫酶（肝、腎），這 些可用過氧化氫進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質或 Fc 片斷而出現胞漿著色，這種著色不易避免，但 可以通過形態學辨認出巨噬細胞而引起重視。內源性生物素的著色有欺騙性，因為它廣泛的存在于組 織細胞中，我們研究結果顯示：冰凍組織中存在內源性生物素，經福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉， 加熱抗原修復后造成內源性生物素暴露，內源性生物素暴露的強度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+） 到強陽性（+++），內源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存 在于胞漿中，內源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內源 性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內源性生物素暴露的強弱與修復液有關，其強度增加依次為： 檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復暴露的內源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測系統 Polymer 兩 步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干擾。 7、 細胞核著色 不適當的組織處理可以出現細胞核著色，如組織在二甲苯里浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期 一）、緩沖液中浸泡時間太長、組織變干、微波修復液的 pH 值和修復時間不當或修復過程中修復液留下得 太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規進行工作。