小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型

缺血再灌注損傷，即缺血器官、組織重新獲得血液供應，不僅不能使組織、器官功能恢復，反而加重了功能代謝障礙及結構破壞。對麻醉動物的肝中葉和肝左葉的門靜脈和肝動脈進行阻斷和再通，由于肝臟中葉和左葉血流的阻斷和再通，引起肝臟中葉和左葉明顯的再灌注損傷。肝臟缺血過程中由于肝細胞內ATP迅速耗盡，導致乳酸酮體等的堆積，及線粒體氧化磷酸化功能低下，引發代謝性酸中毒，缺血過程中細胞缺氧使ATP含量下降，導致肝細胞內外Ca2 +重新分布，即Ca2 +內流，引起線粒體的損傷。再灌注過程中由于氧自由基的爆發性增多，中性粒細胞的聚集，kupffer細胞的激活，細胞凋亡及其他多種細胞因子的作用，使得肝細胞膜損傷，內皮細胞損傷及肝臟微循環障礙等導致肝臟功能代謝障礙及結構破壞。

    1.實驗動物

SPF級Balb/C小鼠，雄性，周齡為4w~6w，體重為20g~22g。

2.實驗分組：

    實驗分六組：正常對照組、模型組、陽性藥組、受試藥組三個劑量組，每組15只動物。

3.實驗周期

    0h、3h、6h、12h、24h、72h

    4.建模方法

1 小鼠術前12 h禁食，自由飲水。

2 3%戊巴比妥鈉80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后將小鼠平躺在手術臺上膠帶固定四肢，將小鼠腹部術去毛，用碘酒和75％乙醇術區消毒。

3 取腹正中切口25px，打開腹腔，小心分離出肝臟左、中葉之肝蒂（左、中葉肝臟供血的門靜脈和肝動脈）。

4 用無創血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，使約70%的肝臟缺血，以防止發生嚴重腸系膜靜脈淤血。0.5min后，與非阻斷的右葉相比，肉眼可見阻斷葉明顯變白，說明阻斷成功，用止血鉗夾閉皮膚切口臨時關閉腹腔，同時將小鼠放在37℃恒溫加熱墊上保溫。

5 完成持續缺血60min后，重新打開腹腔，迅速取出血管夾，恢復缺血肝血流，0.5min左右可見缺血區肝臟由白色逐漸恢復為鮮紅色表明再灌注成功，逐層縫合腹腔肌肉和皮膚關閉腹腔，完成手術。待小鼠清醒后放回飼養室飼養，密切關注小鼠的狀態及生存狀況并做好記錄。

6 術后分別于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h麻醉小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2h后于4℃3000r離心10分鐘提取血清，放入-80冰箱凍存。采用全自動生化分析儀檢測血清中ALT（谷丙轉氨酶）、AST（天門冬氨酸氨基轉移酶）的水平。同時統一取肝左葉組織1．125px×25px×0．50px留作病理標本或分生標本。

  5.模型評價

1 分別檢測術后0h、3h、6h、12h、24h及72h小鼠血清中ALT（谷丙轉氨酶）、AST（天門冬氨酸氨基轉移酶）的水平。

2 統一取肝左葉組織1．125px×25px×0．50px于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脫水，包埋，進行石蠟切片后行HE染色，tunel染色。作壞死評分。肝小葉結構嚴重破壞，網狀纖維支架塌陷，肝細胞壞死，空泡變樣，肝細胞索、肝竇充血腫脹，邊界不清，周圍有炎性細胞浸潤。

肝臟缺血損傷評分：

0分：無肝細胞損傷

1分：輕度損傷，特點為細胞質空泡化，病灶核固縮

2分：中度損傷，血竇膨脹，細胞溶質空泡化，細胞邊界模糊

3分：中度到重度損傷，凝固性壞死，大量血竇膨脹，紅細胞滲出到肝鎖，嗜伊紅細胞增多，中性白細胞著邊（附著于血管壁）

4分：嚴重壞死，失去肝臟結構，肝索崩解，出血，嗜中性粒細胞滲入 

3 細胞因子的檢測

肝臟損傷后，血清中TNFα、IFNγ、IL-2、IL-6、ICAM1等細胞因子的表達顯著升高，可以用ELISA 法檢測。

6 注意事項

6.1 分離肝門時用棉簽分離，可避免對肝臟的損傷

6.2術前禁食有利于手術進行

6.3阻斷血流要一次成功，否則會造成缺血預處理，減輕損傷程度

6.4取材時鑷子不要損傷肝臟