關鍵詞:多肽合成技術服務|實驗技術服務
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多肽合成技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
多肽是一種與生物體內各種細胞功能都相關的生物活性物質，它的分子結構介于氨基酸和蛋白質之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成的化合物。多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質的總稱，常常被應用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發等領域。
具體合成由下列幾個循環組成：
1） 去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。
2） 激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環：這兩步反應反復循環直到合成完成。
3） 洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護。
試劑檢測：沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。
固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。
Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接*。
其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等.
氨基酸保護基 
20種常見氨基酸，根據側鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學合成中氨基酸的保護非常關鍵，直接決定了合成能夠成功的關鍵。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側鏈的，需要進行保護，一般要求，這些保護基在合成過程中穩定，無副反應，合成結束后可以*定量的脫除。合成中需要進行保護的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進行保護的基團：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護，因為吲哚性質比較穩定。當然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護，象，Asn，Gln ，Thr，Tyr。
多肽縮合試劑 
目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應，zui早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應試劑危險以及制備比較復雜，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結構可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。 
液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液相多肽合成現在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規模大，合成成本低的顯著優點，而且由于是在均相中進行反應，可以選擇的反應條件更加豐富，象一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應效率低，以及副反應等原因，無法應用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應策略。 
合成多肽分析鑒定方法 
多肽的分析鑒定方法有多肽一級結構，二級結構鑒定，多肽一級結構包括：質譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級結構包括：圓二色譜（CD），NMR，X-衍射等方法。 
純度分析 
多肽的純度分析，一般都采用HPLC進行分析，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度，5%B--65%B，時間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強，在C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫；另外一個方法是在流動相中加入強離子對試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。 
質譜分析 
質譜分析的目的主要是確證分子量，當然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是這個需要比較全的數據庫作為基礎，分析才能比較準確。由于多肽性質不穩定，需要采用軟電離技術，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS），基質輔助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS通常會給出多電荷峰，電荷數目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數目有關，因此，經常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷，因此數據直接對應了分子離子峰，容易分析。此外，通常在分析長肽或蛋白過程中，需要添加NH4，Na，K等離子，提高靈敏度，所以一般在 MS中出現一組峰，分別對應：（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。 
氨基酸組成分析 
氨基酸組成分析一般需要產品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類，數目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110℃，用6M鹽酸水解16至72小時。酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因為天冬酰胺和谷氨酰胺的側鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環容易被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環也幾乎都被破壞了。因此蛋白質的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計的，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能測定，要測量需要在蛋白質水解之前進行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
多肽要在幾分鐘內高度被分析。
HPLC分兩類:離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。 分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度， 或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽從柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100(3-10μm)和25×250mm(10μ m)。
大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點:硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH，因為這樣會破壞柱子。