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小G蛋白，是具有GTP酶活性的一類蛋白，因其分子量只有20—30KD而得名。第一個被發現的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的產物。根據序列的同源性，小G蛋白被分成若干亞家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。

小G蛋白家族成員在細胞信號通路中具有分子開關的功能，并參與調控許多生物學過程。下面小優就帶大家一起來看看小G蛋白具體的功能以及研究方法吧～

Part1 小G蛋白的功能

1、Rho 亞家族

Rho 亞家族由 20 多個成員組成，目前研究得最多的是 Rac1、RhoA 和 Cdc42 蛋白。 Rho 蛋白主要通過一系列效應蛋白傳遞細胞信號，從而參與了廣泛的細胞反應，包括細胞骨架重組1-2、轉錄調控3、細胞遷移4、細胞轉化和轉移5。

Rac1是一種分子量為21kDa的GTPase，由192個氨基酸編碼組成。Rac1在多種細胞活動中起分子開關作用，包括細胞運動、發育、信號轉導、細胞骨架組織、免疫反應、細胞周期、細胞間粘附、上皮分化，以及控制GLUT4轉運以攝取葡萄糖。

RhoA 蛋白由 193 個氨基酸組成，分子量約為 22 kDa ，在調節肌動蛋白細胞骨架的動態組織（如聚合、肌動蛋白收縮性、應力纖維形成）以及調控依賴于動態肌動蛋白細胞骨架的細胞功能發揮著重要作用。此外，RhoA 還參與微管動力學的調控過程。

Cdc42是一個21.3 kDa的小GTPase蛋白，由191個氨基酸編碼。Cdc42在多種依賴于肌動蛋白細胞骨架的細胞過程中發揮重要作用，如胞質分裂、吞噬、細胞遷移、形態發生、趨化、軸突引導、軸突成髓鞘、細胞內運輸、基因轉錄、細胞周期調控和細胞命運決定等。

2、Ras 亞家族

Ras亞家族大約有 10 個成員，分為 Ras、Ral 和 Rap 蛋白。Ras 蛋白在控制增殖和分化的 Raf/ERK 信號通路中發揮作用；Ral 蛋白在內吞作用的早期階段發揮作用； Rap 蛋白則是 Ras 蛋白的拮抗劑，它們位于晚期核內體和早期溶酶體區。

K-Ras 是三種 Ras 致癌異構體之一（其他兩種為 N-Ras 和 H-Ras），由 189 或 188 個氨基酸組成，分子量為 21 kDa。與其他小G蛋白一樣，K-Ras在非活性（GDP 結合）和活性（GTP 結合）狀態之間循環，是許多不同信號級聯和細胞過程的分子開關。K-Ras 參與不同類型的配體介導的信號轉導途徑，通過向細胞質和核仁傳遞有絲分裂和生長信號，影響細胞的增殖、分化、轉化和凋亡。

3、Ran 亞家族

Ran 蛋白調節大分子的核運輸，并在從 DNA 復制到進入有絲分裂的細胞周期檢查點中起作用。

4、Rab 亞家族

作為最大的小 G 蛋白亞家族之一，Rab 蛋白調節著囊泡從 ER 到高爾基體再到質膜的流動過程，它們普遍表達，并且含量高。

5、Arf 亞家族

Arf 家族由 Arf 蛋白和類 Arf 蛋白（Arl's）組成6，它是小 G 蛋白家族中分歧最大的，與異源三聚體 G 蛋白家族有相同的親緣關系。Arf 蛋白在核膜融合、高爾基體囊泡轉運負調控和質膜內陷過程中起到協助作用。

6、Rad/Rem/Gem/Kir 亞家族

RGK 亞家族的成員具有廣泛的功能，如控制心肌肥大、抑制肌細胞和脂肪細胞系中胰島素刺激的葡萄糖的攝取，以及通過與 b-亞基結合抑制電壓依賴性鈣通道7。

Part2 小G蛋白的研究工具

針對小G蛋白的研究有多種方式，如測量活化的“GTP結合"形式、測量小G蛋白的總蛋白水平、 測定GTP和GDP之間互相轉換的活性（Guanine exchange factors，GEFs，鳥嘌呤核苷酸交換因子）、測定內源性GTP酶速率，下面小優就為大家分別介紹這幾種測量方法以及相關的研究工具。

1、小G蛋白的 GTP 結合活性測定

小G蛋白的活性測定有兩種方法：pull-down和G-LISA。以Rho蛋白的活性測定為例，pull-down法就是將 Rho 效應子的 Rho-GTP 結合域 (RBD) 與瓊脂糖珠耦合，以親和力為基礎檢測生物樣本中的活性 Rho8。這種方法有幾個缺點，如耗時長、需要大量細胞的總蛋白、可同時處理的樣本數量有限以及只能得出半定量結果。Cytoskeleton 推出的 G-LISA 技術將這一概念的準確性和靈敏度提升到了一個新的水平，該技術使用 96 孔格式和少量細胞/蛋白質，可提供高度準確的結果。

表：Pull down試劑盒 & G-LISA™試劑盒的對比

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2、小 G 蛋白總含量測定

小 G 蛋白的總水平曾一度被認為是細胞信號傳導中無關緊要的旁觀者，但科學家經過后續的研究，已經證實其是影響正常和患病細胞功能的真正因素。使用 WB或ELISA可以測量細胞或組織提取物中的小 G 蛋白總含量。

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3、GEF活性測定

GEF（Guanine exchange factors，鳥嘌呤核苷酸交換因子） 催化 GDP 與 GTP 的交換，使小 GTP 酶在細胞外信號的作用下產生活性。為了促進交換，GEF 必須與GDP - GTP 酶結合，從而破壞 GDP-GTP 酶復合物的穩定性，然后穩定無核苷酸的反應中間體。由于細胞內 GTP 與 GDP 的比例很高，釋放出的 GDP 會被 GTP 取代，從而導致 GEF 從復合物中釋放出來并激活 GTP 酶。許多 GEF 蛋白已被確認為致癌基因，并與癌癥等人類疾病有關。然而，由于GEF 蛋白的表達具有組織或細胞類型特異性，因此研究小G蛋白能為癌癥治療提供新的研究方向。

最近開發的鳥嘌呤核苷酸熒光類似物大大提高了確定 GEFs 實時交換反應的能力，包括動力學和熱力學性質，從而無需使用傳統的放射性標記方法。這種基于熒光的檢測方法利用了鳥嘌呤核苷酸的結合和非結合熒光類似物之間的光譜差異，因此能夠監測小 GTP 酶的狀態。廣泛使用的熒光類似物之一是mant熒光團，它在360nm處被激發，在440nm處發出熒光。一旦與 GTPases 結合，mant熒光團的發射強度會急劇增加約 2 倍，因此，小 GTP 酶和 GEF 存在時熒光強度的增強將反映出已知或未知蛋白質各自的 GEF 活性。

下圖展示了一種基于Mant熒光團的GEF檢測方法，適用于96孔和384孔。該測定可應用于多種研究，例如以高通量篩選的形式表征GEF和GEF抑制劑。使用RhoGEF Exchange Assay試劑盒（BK100）來測定GEF活性，該試劑盒中含有人Cdc42, Rac1和RhoA蛋白和Dbs的GEF結構域，作為Cdc42和RhoA的陽性對照GEF（圖1），Dbs顯示Rac1的GEF活性極低（圖2）。有趣的是，在基于FRET的實驗中，人類Dbs可以激活Rac1。

圖1. Cdc42, RhoA和 Rac1的GEF活性

圖2. 96 孔板中 Cdc42、RhoA 和 Rac1 的 Dbs 交換活性。所示數據為三次實驗的平均值。

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4、內源性 GTPase 速率測定

GTP與GDP結合狀態的平衡，是它們從激活狀態(GTP形式)轉向非活動狀態(GDP形式)時的轉換機制的基礎。GTP 與 GDP 結合狀態的平衡由催化蛋白控制的，這些催化蛋白可以增加 GDP 與 GTP 的交換速率（GEFs），提高 GTP 酶的活性（GAPs），或阻止 GDP 的交換（GDIs）。最近的研究表明，GAP 蛋白家族有 70 個成員，規模龐大，在細胞從正常狀態轉變為疾病狀態時發揮著重要的作用9。

細胞中的 GAP 活性可通過缺失或突變而降低，在這種情況下，GAP 所作用的小 GTP 酶處于活性 GTP 狀態的時間延長，實際上就形成了一種永jiu活性狀態。例如，Rho GTPase 控制著軸突導向的能力，一旦發生 Rho-GAP 的突變就會導致智力遲鈍；突變的 Ras-GAP（NF1 基因）已被證明可導致神經纖維瘤病10；而突變的 Rheb-GAP 已被證明可導致結節性硬化綜合癥11。

目前已知的某些 GAP 具有 GAP 活性，其中大多數GAP 蛋白只是通過同源性才被認為含有 GAP 活性。Cytoskeleton推出了 GAP 活性檢測試劑盒，為這一領域的探索提供了便利。試劑盒中的試劑經過優化，可使 GAP 蛋白具有高活性，這樣就可以通過簡單的吸光度檢測方法來檢測小 G 蛋白增強的 GTPase。

圖3. 通過 RhoA 和 Rac1 蛋白水解 GTP 測定 p50 RhoGAP 活性

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參考文獻：

1.Ridley, AJ. & Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-399 (1992)

2.Ridley, AJ. et al. The small GTP-binding protein Rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell 70: 401-410 (1992)

3.Coso, OA., et al.  The small GTP-binding proteins Rac and Cdc42 regulate the activity of the JNK/SAPK signaling pathway.  Cell 81: 1137-1146 (1995)

4.Small, JV., et al. The lamellipodium: where motility begins.  Trends Cell Biol. 12: 112-120 (2002)

5.Jaffe, A, & Hall, A,  Rho GTPases in transformation and metastasis, Adv. Cancer Res. 84: 57-80 (2002)

6.Clark et al. 1993. Selective amplification of novel members of the ADF-ribosylation factor (Arf) family: cloning of new human and Drosophila ARL genes. PNAS, 90, 8952-6.

7.Chang L. et al. 2007. Rad GTPase Deficiency Leads to Cardiac Hypertrophy. Molecular Cardiology, 116: 2976-2983.

8.Herrmann, C., Martin, G.A. and Wittinghofer, J. Biol. Chem. 270: 2901 (1995)

9.Bernards A. and Settleman J. 2004. GAP control: regulating the regulators of small GTPases. Trends Cell Biol. 14, (7), 377-385.

10.Cichowski K. and Jacks T. 2001. NF1 tumor suppressor gene function: narrowing the GAP. Cell. 104, 593-604.

11.Li Y. et al. 2004. TSC2: filling the GAP in the mTOR signaling pathway. Trends Biochem. Sci. 29, 32-38.