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原代細胞分離提取方法及注意事項
閱讀：516 發布時間：2023-8-21
原代細胞是直接取自活組織(例如活組織檢查材料)的細胞，并建立用于體外生長。這些細胞經歷了非常少的群體倍增，因此與連續(腫瘤或人工永生化)細胞系相比，它們更能代表它們所衍生組織的主要功能成分，使得原代細胞成為更具代表性的體內模型。
原代細胞分離是指將組織分散制成細胞懸液后從中獲取目的細胞的過程，獲得高純度、高活性的原代細胞則是很多細胞實驗成功的關鍵要素之一，原代細胞分離的方法有很多種：懸浮離心法、直接組織塊法、酶消化法、非酶消化法、機械分散法等。
人或動物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密，不利于各個細胞在體外培養中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長，若需獲取大量細胞，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來，常采用的方法如下：
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養基洗一次后，調整適當細胞濃度后再分瓶培養，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。
(一)機械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(用九號針)，使細胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網內用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細胞從網孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。
(二)消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長。
消化分離法的操作步驟
1)剪切把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
2)加液漂洗將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜，自然沉降法)。
3)消化加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當時間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。
4)棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
5)漂洗將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次后，加入培養基。
6)機械分散采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養。
注意事項如下
1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
2)胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產生，而且動作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失
三、酶消化法
1）無菌
確保使用無菌設備、試劑和技術收集和處理組織。使用個人防護設備以避免污染。使用0.22微米的膜無菌過濾所有酶和試劑。
2）切塊
用無菌剪刀或手術刀將組織標本切成小塊(通常為2×4mm)，然后將小塊放入選定的緩沖液、培養基或鹽溶液中。
3）加酶
將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您選擇的酶如膠原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，約0.5 mg/ml～1.5mg/ml的酶。
4）孵育
將組織樣本在其最佳溫度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分鐘。定期混合或輕輕搖動標本。
5）洗滌
通過輕輕移液來分散細胞(也稱為研磨)，然后，使用細網過濾細胞懸浮液。讓細胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次。含有FBS，BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化。
6）分析
將細胞重懸于正確的培養基或緩沖液中，然后定量測定細胞產量和活力。這是細胞分離過程中的重要步驟，因此您可以評估解離技術的結果。大多數研究人員使用血細胞計數器測定細胞產量，并使用臺盼藍重氮染料測量細胞活力。
7）培養
這個適合，就可以根據所分離的細胞來選擇適合研究的方案和處理步驟來培養細胞了。
重點注意事項
1）使用細胞分離酶時，請注意溫度和濕度條件。如蛋白水解酶可以自動分解，因此建議在使用前立即將其溶解，并在冰上保存2℃～8℃。
2）通常用于細胞分離的大多數酶可以直接溶解于平衡鹽溶液或所選緩沖液中。對于許多細胞分離中，確保解離期間的組織存活，需要孵育培養基充分氧化并在生理pH下緩沖。95%O2、5%CO2平衡的介質來完成。