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上海添時T960 PCR儀的改進與完善史
T960 PCR儀就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。目前常用的技術,可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。根據DNA擴增的目的和檢測的標準,可以將T960 PCR儀分為普通T960 PCR儀,梯度T960 PCR儀,原位T960 PCR儀,實時熒光定量T960 PCR儀四類。
T960 PCR儀的改進與完善
Mullis初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段,其缺點是:
①Klenow酶不耐高溫, 90℃會變性失活,每次循環都要重新加。
②引物鏈延伸反應在37℃下進行,容易發生模板和引物之間的堿基錯配,其T960 PCR儀產物特異性較差,合成的
DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的T960 PCR儀技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點,
但由于Klenow酶不耐熱,在DNA模板進行熱變性時,會導致此酶鈍化,每加入一次酶只能完成
一個擴增反應周期,給T960 PCR儀技術操作程序添了不少困難。這使得T960 PCR儀技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。
1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行T960 PCR儀,其擴增的DNA片段很均一,真實性也較高,只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次,仍需加入新酶。
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點:①耐高溫,在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化,不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率,增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率,因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區別,將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的發現使T960 PCR儀廣泛的被應用。