豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)試劑盒說明書

(HerdCheck* PRRS X3)

名稱和用途

HerdCheck* PRRS X3 抗體檢測(cè)試劑盒是用于檢測(cè)豬血清和血漿中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。

概述

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種動(dòng)脈炎病毒，在80 年代后期在歐洲和美國(guó)發(fā)現(xiàn)，兩種毒株具有不同的抗原性1。該病毒引起繁殖問題（ 產(chǎn)弱仔，死胎， 母豬死亡）、呼吸系統(tǒng)疾病（肺炎，呼吸困難，行動(dòng)遲緩，死亡）和輕度神經(jīng)癥狀1。豬繁殖與呼吸綜合征引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被認(rèn)為是影響?zhàn)B豬業(yè)zui重要的疾病之一?？梢酝ㄟ^便捷的檢測(cè)血清或血漿中的抗體評(píng)估豬只是否感染PRRSV（無論是自然感染或人工免疫疫苗）。需要注意的是這種檢測(cè)抗體的免疫學(xué)方法需要對(duì)不同的PRRS 毒株的檢測(cè)都很敏感。

此試劑盒僅供體外檢測(cè)使用。

原理

HerdCheck* PRRS X3 抗體檢測(cè)試劑盒是用于檢測(cè)豬血清和血漿中PRRSV IgG 抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。將重組的PRRSV抗原包被在微孔滴定板上，被測(cè)樣品在包被孔中孵育時(shí)，針對(duì)PRRSV的特異性抗體與包被的抗原形成抗原抗體復(fù)合物，洗去包被孔中沒有結(jié)合的成分后，加入辣根過氧化物酶（HRPO）標(biāo)記的抗豬抗體，它與孔中的豬抗體結(jié)合，在試驗(yàn)的zui后步驟，洗去沒有結(jié)合的酶標(biāo)抗體，再加入酶底物和顯色劑TMB，顏色反應(yīng)的深淺由樣品中存在的抗PRRSV 特異性抗體的量決定。

試劑

所有試劑于2-8℃保存。

1. 重組PRRS 抗原包被板 5 塊

2. PRRSV 陽性對(duì)照 4 ml

3. 陰性對(duì)照 4 ml

4. HRPO 標(biāo)記抗豬IgG 抗體 60 ml

5. 樣品稀釋液 120 ml

A. 10 倍濃縮洗滌液 235 ml

B. TMB 底物液 60 ml

C. 終止液 60 ml

自備器材

適合 5-1000 μl 的微量移液器或連續(xù)移液器

一次性移液器吸頭

量筒，500 ml，配制洗滌液用

96 孔板酶標(biāo)儀

蒸餾水或去離子水

滴加和吸去洗滌液的設(shè)備

吸液用的真空和控制裝置

樣品稀釋的管子

使用注意事項(xiàng)

處理所有的生物材料，可能為潛在的傳染源。

不要用口移液。

使用樣品或試劑盒的場(chǎng)所不要吸煙，喝水和吃東西。

TMB 底物和終止液對(duì)皮膚和眼可能有刺激性，避免底物與皮膚和眼睛接觸。

TMB 不要暴露于強(qiáng)光或任何氧化劑。取用TMB 顯色液要用潔凈的玻璃或塑料容器。

所有的試劑應(yīng)在2-8℃儲(chǔ)存。使用前拿到室溫（18-25℃），使用后放回2-8℃儲(chǔ)存。

所有的廢棄液應(yīng)在丟棄前合理處理，以免污染。

注意防止試劑盒內(nèi)的試劑污染。

不要使用過期的試劑，不同批次的試劑盒成分不要混用。

嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)和洗滌等全部過程必須。

每次檢測(cè)時(shí)都要設(shè)立陰陽性對(duì)照。

在檢測(cè)過程中，僅使用去離子水或蒸餾水稀釋和準(zhǔn)備試劑。

未用完的微孔板/條應(yīng)用塑料袋密封并儲(chǔ)存于2-8℃。

僅供獸醫(yī)使用。

試劑的準(zhǔn)備

用樣品稀釋液40 倍稀釋被測(cè)樣品（例如：5 μl 樣品加195 μl 樣品稀釋液）。

注意：不要稀釋陽性和陰性對(duì)照。

取每個(gè)樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個(gè)樣品在板上的位置。每個(gè)樣品在添加到PRRSV 包被板前應(yīng)混勻。

洗滌液的準(zhǔn)備

濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫（18-25℃），并搖動(dòng)使沉淀鹽溶解。使用前濃縮洗滌液應(yīng)用蒸餾水或去離子水10 倍稀釋（例如：每塊反應(yīng)板需要30 ml 濃縮洗滌液加入270ml 蒸餾水或去離子水中）。

操作步驟

使用前所有試劑應(yīng)恢復(fù)至室溫（18-25℃）。試劑應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩混合。每個(gè)樣品使用一個(gè)獨(dú)立的吸頭。

1. 取出抗原包被板，在記錄表上記錄樣本的位置。

2. 在包被孔內(nèi)加入100μl 沒有稀釋的陰性對(duì)照，每次檢測(cè)加兩孔。

3. 在包被孔內(nèi)加入100μl 沒有稀釋的陽性對(duì)照，每次檢測(cè)加兩孔。

4. 在相應(yīng)的孔中加入100μl 已稀釋好的樣本。

5. 18-25℃孵育30±2 分鐘。

6. 吸取各孔的液體棄入廢液筒。

7. 用大約300 μl 洗滌液洗滌板孔，共洗滌3-5 次。每次洗滌后應(yīng)吸去孔內(nèi)的液體。注意：應(yīng)避免包被孔干燥。在zui后一次洗滌液吸去后，將每塊板中殘留的洗滌液扣拍到吸水材料上。

8. 每孔加入100 μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬IgG 抗體。

9. 18-25℃孵育30±2 分鐘。

10. 重復(fù)步驟6 和7。

11. 每孔加入100μl TMB 底物液。

12. 18-25℃孵育15±1 分鐘。

13. 每孔加入100μl 終止液，終止反應(yīng)。

14. 測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的吸光值A(650)。

15．計(jì)算結(jié)果。

結(jié)果

符合下列條件，試驗(yàn)方能有效：

陽性對(duì)照的平均值減去陰性對(duì)照的平均值必須大于或等于0.150；此外，陰性對(duì)照的平均值（NCx）必須小于或等于0.150。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，應(yīng)按照操作說明書重做一次試驗(yàn)。PRRS 抗體的陽性/陰性通過計(jì)算樣品與陽性對(duì)照（S/P）的比值進(jìn)行判定。具體計(jì)算方法見樣品結(jié)果計(jì)算部分。

結(jié)果計(jì)算

1．陰性對(duì)照平均值的計(jì)算（NCx）：

NCx=(NC1 A650+ NC2 A650) /2例如：（0.064+0.08）/2=0.072

2．陽性對(duì)照平均值的計(jì)算（PCx）：

PCx=(PC1 A650+ PC2 A650) /2 例如：（0.560+0.596）/2=0.578

3．樣本/陽性對(duì)照比率的計(jì)算（S/P）:

S/P=(樣本A(650)－NCx) /(PCx－NCx)

例如：如果樣品的A（650）=0.750， S/P=（0.750-0.072）/(0.578-0.072)=1.34

結(jié)果闡述

PRRS 抗體的有無（陽性/陰性）通過計(jì)算每個(gè)樣品的S/P 值判定。

1. 如果S/P 值低于0.4，樣品應(yīng)判定為PRRS 抗體陰性。

2. 如果S/P 值大于或等于0.4，樣品應(yīng)判定為PRRS 抗體陽性。