體液外泌體(Exosome)提取試劑(包括乳汁、唾液、尿液等）

適用范圍：

1、可用于后續電鏡觀察、NanoSight納米粒度分析，加入細胞共培養，Western blot、ELISA、蛋白質組學分析，小RNA提取和qPCR。

2、只需少量樣品、孵育和臺式離心，外泌體回收率穩定、結構完整純度高。

3、媲美SBI公司ExoQuick和Invitrogen的Total Exosome Isolation外泌體分離試劑盒，是國內性加比zui高的外泌體提取試劑盒

描述：細胞內存在許多膜性囊泡(vesicle)結構，可以分泌排到胞外--即外泌體(exosome)，也稱為microvesicle或microparticle--它們均可稱為extracellular vesicle。外泌體直徑約30~150 nm，攜帶多種核酸，蛋白酶、MHC、骨架蛋白、熱休克蛋白、miRNA和脂質信號分子。外泌體分泌到細胞外基質后，可jing血液、尿液、腦脊液、唾液、乳汁、淋巴等體液運送到相鄰或遠隔的組織細胞并被其攝取，因而在同類或不同類型的細胞間的物質和信息遠程交換中起重要作用。外泌體調節許多細胞功能，如免疫調控、腫瘤新生和轉移，或為疾病早期診斷標志物，也可作為藥物載體。

外泌體分離純化的經典方法是超速離心或密度梯度離心法，但需要超速離心機和大量樣品、操作繁瑣耗時，回收率和純度不穩定。外泌體制備試劑盒能替代超速離心法，適應少至100µl 的樣品，只需孵育和臺式離心，即可制備出高純度外泌體，用于后續蛋白、RNA檢測試驗。

操作步驟

1.       樣品預處理：3000× g離心15分鐘去除細胞和碎片，上清轉移到新管用于提取外泌體。如需制備更高純度的外泌體，可用0.22µm濾膜過濾離心上清一次。

2.       每1體積的樣品，加入0.2體積的外泌體純化試劑。例如1ml樣品加0.2ml外泌體純化試劑，5ml樣品加1ml外泌體純化試劑，充分混勻。

3.       4 ºC孵育12小時，無需搖動。注意：血清血漿富含蛋白，孵育可縮短至1個小時。

4.       1500× g離心15分鐘收集外泌體沉淀，棄上清。常溫或4 ºC離心不影響結果。

5.       1500× g再次離心5分鐘，小心吸除殘余液體，勿觸動外泌體沉淀。

6.       加100µl PBS重懸外泌體沉淀。若初始樣品及外泌體沉淀多可多加PBS重懸。后續若進行Western blot可直接加50-100 µl RIPA Lysis Buffer裂解外泌體。如提取RNA可在PBS重懸外泌體后，采用RNAtrip LS 液體樣品RNA提取試劑R1020提取外泌體RNA。

說明：通常1 ml細胞培養上清分離的外泌體能滿足一次Western blot實驗。外泌體常見標志蛋白CD63, CD9, CD81, Tetraspani, HSP70，可用RIPA Lysis Buffer、全套Western blot試劑、Super ECL Plus超敏發光液檢測。RNAtrip LS液體樣品RNA提取試劑可純化外泌體小RNA。 

若提取外泌體用于蛋白分析，對于外泌體含量高的樣品：血清、血漿、腹水、唾液、乳汁，可采用500µL (或100-500µL)的初始樣品量，再加入等體積的預冷PBS緩沖液稀釋混勻，然后根據稀釋后的終體積，再加入0.2體積的外泌體提取試劑。對于外泌體含量較低的樣品：組織塊培養上清、細胞培養上清、尿液、腦脊液，可采用1 ml樣品體積，不用PBS稀釋，處理后直接加入提取試劑。若提取的外泌體用于小RNA和qPCR分析，建議采用較大體積的樣品，例如5-10ml。

采用EDTA而非肝素抗凝血，以免影響后續PCR。