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GENMED 細胞培養基谷氨酰胺比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版） 主要用途
GENMED 細胞培養基谷氨酰胺比色法定量檢測試劑是一種旨在通過谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶的雙酶循 環反應系統測定細胞培養基樣品中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）的消耗量，即采用比色法測 定其氧化后峰值的變化，進行測算谷氨酰胺含量的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研 制、成功實驗證明的。其適用于細胞培養前和培養中的各種細胞培養基中谷氨酰胺的檢測。產品嚴格無菌， 即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
L-谷氨酰胺是構成人體蛋白質所必需的20種氨基酸之一。是人體內zui普遍的、不可缺乏的條件性必需氨基 酸，是構成蛋白質*的氨基酸之一，更是某些細胞培養中zui基本的元素。由于谷氨酰胺不穩定的特 性，在細胞培養基的整合中，易自發性分解為谷氨酸和氨離子，而氨離子對細胞的毒性很強，因此，在細 胞培養體系中，須密切關注谷氨酰胺的儲存壽命（SHELF LIFE）和實時監測。在谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫 酶的雙酶循環反應系統中，L-谷氨酰胺首先發生脫氨基反應，產生谷氨酸和氨離子；進一步氨與2-酮戊二 酸反應再次產生谷氨酸，同時將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）氧化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP+），即測定NADPH（340nm 波長）的濃度變化，來定量分析谷氨酰胺的含量， 其反應方式為：
產品內容
GENMED 緩沖液（Reagent A） 毫升 GENMED 反應液（Reagent B） 微升 GENMED 陰性液（Reagent C） 毫升 GENMED 酶促液 I（Reagent D） 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 微升 產品說明書 1 份
保存方式
保存 GENMED 反應液（Reagent B）、GENMED 酶促液 I（Reagent D）和 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 在－20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里；GENMED 反應液（Reagent B）避免光照；有效保證 6 月
用戶自備
無離子水：用于溶解樣品 過濾紙：用于樣品澄清處理 封口膜：用于樣品密封
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15 毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器 比色皿：用于比色的容器 96 孔酶標板：用于比色的容器 分光光度儀：用于比色分析 酶標儀：用于微量樣品比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 GENMED 反應液（Reagent B）、GENMED 酶促液 I（Reagent D）和 GENMED 酶促液 II（Reagent E）置入冰槽里融化。GENMED 反應液（Reagent B）避免光照；同 時設定好分光光度儀（溫度為 25℃）：波長 340nm，并置零。然后進行下列操作。 一、（選擇操作）樣品準備（注意：參見注意事項4） 1． 移取 5 毫升待測細胞培養基到 15 毫升錐形離心管 2． 放進臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 1500g 3． 移取上清液到新的 15 毫升錐形離心管 4． （選擇步驟）可以加入適量的用戶自備的無離子水稀釋（如果 L－谷氨酰胺濃度過高） 5． （選擇步驟）過濾紙過濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈） 6． 封口膜封口備用 二、背景對照定 1． 移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升 GENMED 陰性液（Reagent C） 3． 加入 xx 微升 GENMED 酶促液 I（Reagent D） 4． 上下傾倒數次，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘 6． 放進分光光度儀，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反應液（Reagent B） 9． 上下傾倒數次，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進分光光度儀測讀（此為初始讀數） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下傾倒數次，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（此為終點讀數） 16．實際讀數（初始讀數－終點讀數）：此為背景空對照實際讀數 三、樣品總活性測定 1． 移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 25 微升上述制備的待測樣品（注意：樣品須清澈）
3． 加入 xx 微升 GENMED 酶促液 I（Reagent D）
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4． 上下傾倒數次，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘 6． 放進分光光度儀，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反應液（Reagent B） 9． 上下傾倒數次，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進分光光度儀測讀（此為初始讀數） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下傾倒數次，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（此為終點讀數） 16．實際讀數（初始讀數－終點讀數）：此為樣品總活性讀數 四、 樣品非特異活性測定 1． 移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 25 微升上述制備的待測樣品（注意：樣品須清澈） 3． 加入 xx 微升 GENMED 陰性液（Reagent C） 4． 上下傾倒數次，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘 6． 放進分光光度儀，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反應液（Reagent B） 9． 上下傾倒數次，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進分光光度儀測讀（此為初始讀數） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下傾倒數次，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（此為終點讀數） 16．實際讀數（初始讀數－終點讀數）：此為樣品非特異活性讀數 五、 計算樣品濃度： [（樣品總活性讀數－樣品非特異活性讀數－背景讀數）X 樣品稀釋倍數 Xxx（毫升，測定容量）]÷[xx（樣 品容量，毫升）Xxx（毫摩爾吸光系數）]＝微摩爾/毫升÷（樣品重量）毫克/毫升＝微摩爾/毫克 六、 酶標板測定 1． 在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照、樣品總活性、樣品非特異活性 2． 分別移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到相應孔中
3． 按下表分別加入：
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背景對照孔
樣品總活性孔
樣品非特異活性孔
GENMED 陰性液（Reagent C）
微升
――
微升
待測樣品
――
微升
微升
GENMED 酶促液 I（Reagent D）
微升
微升
――
4． 輕輕搖動酶標板，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 6． 放進酶標儀，置零 7． 取出酶標板 8． 分別加入 xx 微升 GENMED 反應液（Reagent B） 9． 輕輕搖動酶標板，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進酶標儀測讀（此為初始讀數） 12．取出酶標板，分別加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．輕輕搖動酶標板，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進酶標儀檢測，此為背景空對照和樣品讀數（此為終點讀數） 16．實際讀數：初始讀數－終點讀數 17．濃度計算： [（樣品總活性讀數－樣品非特異活性讀數－背景讀數）X 樣品稀釋倍數 X xx（毫升，測定容量）]÷[xx（樣 品容量，毫升）X xx（毫摩爾吸光系數）X 0.6]＝微摩爾/毫升÷（樣品重量）毫克/毫升＝微摩爾/毫克
注意事項
1． 本產品為 21 次（10 個樣本）操作，包括背景對照 2． 操作時，須戴手套 3． 本產品檢測范圍在 0 至 50 微克/毫升（0 至 350 微摩爾）谷氨酰胺 4． 如果樣品含有過高的脂質和蛋白成分和過深的色素，建議進行樣品澄清處理（去色、去脂、去蛋白、 去氣體等）；本公司提供 GENMED 谷氨酰胺待測樣品處理試劑盒－GMS19027.6 5． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次 6． 樣品須澄清，至關重要 7． 反應 5 分鐘后比色測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；如果仍有波動，建議適當延長檢測時間， 直至讀數穩定 8． 比色測定后，比色皿須清洗* 9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度 10．本公司提供系列營養學元素檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定