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基質金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒說明書

描述：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解 細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與胚胎發育、形態發生、組 織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的 MMP-2、MMP-9 參與各種生理與病理過程，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視   1。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達 1 nM，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電 泳， 電泳結束后取出凝膠與酶反應 Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮區域，從而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供
MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至 0.1~0.5 μl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性，檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進行 50 次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為 10~15
個，則總計可檢測 500~750 個樣品。
適用: 檢測 MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 組成與儲存 (50 assays)：
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋；
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋；
5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(#P1501), 4 oC。

檢測步驟：
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%。按照標準程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，并 90 oC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。
2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染  Marker   即可。陽 性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100μl 全血與 100μl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等體積混合，取 5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20    mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入  10    ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。
5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37oC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低，應延長孵育時間為 10 小時。
6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區域。透明區域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現透 明條帶。
7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑 色。MMP      條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

說明
1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性。
2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠，作為*記錄保留。

參考文獻：
1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書 P1501

常規考馬斯亮藍 SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高，但所需試劑復雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：
1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠，并緩慢搖動 2h；
2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；
3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動 2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的 藍色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要 2～4h，也可脫色過一夜至清晰的藍色的條帶和干凈 的背景）；
4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在    7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對 凝膠進行處理后保存。
安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學品操作規程處理。 說明：
1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍 R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至 1000ml，混合 1h 后用 Whatman 1 號濾紙過濾，于室溫可無限期保存；
2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；
3. 保存液：7％冰醋酸；
4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用，裝入新容器內，室溫或 4 oC 保存，可反復使用 2-4 次。